Agregación de ácidos húmicos: efecto del ph y la concentración de calcio

Los ácidos húmicos (AH) son los componentes principales de carbono orgánico en el medio ambiente acuático y en el suelo. En su estructura parecen coexistir moléculas pequeñas, macromoléculas y ensamblados macromoleculares (agregados). Juegan un rol clave en la naturaleza dado que contribuyen al crecimiento de las plantas, influyen en la estructura y propiedades físico químicas del suelo y están involucrados en la mayoría de los fenómenos superficiales que ocurren en éste. Una función importante ha sido asignada a los AH en la formación de microagregados en suelos (Bronick & Lal, 2005).

Es importante considerar los factores que influyen en el proceso de agregación de AH. Se ha observado que la disminución del pH promueve la formación de agregados debido a la protonación de grupos funcionales (carboxilatos y fenolatos), lo cual disminuye la repulsión electrostática entre las moléculas y favorece la formación de puentes de hidrógeno (H) intermoleculares. La agregación también ocurre por la presencia de cationes, vía neutralización de cargas y formación de puentes catiónicos (Brigante et al., 2009; Baloousha et al., 2006). Sin embargo no existen datos concretos acerca de la cinética de estos procesos ni del mecanismo por el cual la agregación o precipitación de AH tienen lugar en medios acuosos. Dada la complejidad y naturaleza polidispersa de los AH es razonable asumir que no todos sus componentes participan en la misma extensión en la agregación (Chilom et al., 2009).

Para comprender el mecanismo que gobierna el proceso de agregación y la influencia de las distintas fracciones en la composición de agregados, se plantean como objetivos de este trabajo 1) estudiar la cinética de agregación de AH evaluando el efecto del pH y la presencia de iones Ca2+ y 2) analizar la distribución de partículas de AH durante la reacción de agregación.

 

La muestra de AH se extrajo de un suelo agrícola de la Región Semiárida Pampeana Argentina clasificado como Haplustol Entico de textura franca y con 1,4 % de materia orgánica. Se fraccionó, purificó y liofilizó de acuerdo al procedimiento publicado por la International Humic Substances Society (IHSS) (Swifft 1996). El contenido de carbono y nitrógeno del material extraído, analizado con un equipo LECO Truspec, fue de 52.7 % y 3.4 % respectivamente, hallándose dentro de los valores esperados para este tipo de material.

El ZP del AH en suspensión se midió con un equipo ZETASIZER ZS90 (Malvern, UK). Se determinó la variación del ZP del AH en un rango de pH de 2 a 10 en NaCl 0.01M en ausencia y presencia de Ca2+ 3 mmol l-1. Además, se estudió el efecto de la concentración de Ca2+ (0,25 a 3 mmol l-1) sobre el ZP del AH a pH 5, 7 y 9.

Los estudios cinéticos de agregación de AH permitieron estudiar el efecto del pH y la concentración de Ca2+. Los experimentos se realizaron en un sistema en “batch”, empleando una solución de AH de 50 mg l-1, bajo condiciones controladas de velocidad de agitación (450 rpm), pH (5, 7 ó 9), temperatura (25 ºC) y concentración de Ca2+ (0.8 a 3.2 mmol l-1). A diferentes tiempos de reacción se tomaron alícuotas de la suspensión sobre la cual se cuantificó el AH en solución, previa filtración de la muestra con membranas con tamaño de poro de 0.45 μm (MSI, Westboro). La concentración de AH se determinó por espectrofotometría UV-visible a 500 nm empleando una curva de calibrado realizada a partir de soluciones de AH en un rango de concentraciones de 2 a 50 mg l-1.
 

La figura 1a muestra la variación de ZP del AH como función del pH en soluciones de NaCl en ausencia y presencia de Ca2+. En ausencia de Ca2+ el ZP es relativamente constante (alrededor de -35 mV) entre pH 5 y 10, y se hace menos negativo entre pH 5 y 2. Estos valores indican que el AH posee carga negativa en todo el intervalo de pH estudiado. Las variaciones entre pH 2 y 5 pueden asociarse con la disociación de grupos carboxílicos (-COOH) ya que el rango es coincidente con el punto de equivalencia asignado a este grupo (pH 4.2) (Alvarez Puebla & Garrido, 2005). No se observa un segundo punto de inflexión correspondiente a la ionización de grupos fenólicos (-COH) (pH 9.6). En presencia de Ca2+ el ZP del AH es de alrededor de -15 mV, menos negativo que en el caso anterior y prácticamente independiente del pH en todo el intervalo estudiado. Según Tombácz (1999), valores absolutos de ZP de alrededor de 20 mV corresponden al borde de estabilidad / inestabilidad, lo cual indicaría que el AH está agregado en presencia de Ca2+. La unión del Ca2+ a los grupos funcionales del AH, con la consecuente disminución de la carga, sería la responsable de estos efectos.

Figura 1. a) ZP del AH en presencia de Na+ (inferior) y Ca2+ (superior), b) Influencia de la concentración de Ca2+ en el ZP del AH.

La figura 1b muestra el efecto de la concentración de Ca2+ sobre el ZP del AH a diferentes pH. El ZP decae desde -40 mV a -15 mV entre 0 y 1,5 mmol l-1 de Ca2+, y luego se mantiene aproximadamente constante a concentraciones mayores a 1,5 mmol l-1. No se observan cambios significativos al variar el pH. Los resultados indican que si bien buena parte de los grupos negativamente cargados del AH pueden ser neutralizados por Ca2+, una fracción de ellos permanece sin neutralizar aún a concentración 3 mmol l-1 de Ca2+. Esto es coincidente con los resultados de Majzik y Tombácz (2007), quienes observaron que aún con un exceso de Ca2+ de 5 veces la carga eléctrica del AH el ZP seguía siendo negativo.

Aunque no se muestran aquí, estudios cinéticos indicaron que el agregado de Ca2+ a una solución de AH varía el ZP de manera casi instantánea, lo que permite deducir que la unión de Ca2+ al AH es muy rápida.

La cinética de agregación se evaluó graficando el grado de progreso de la reacción de agregación, α, en función del tiempo. α se define como: α=cA/c0, donde cA es la concentración de AH que se encuentra formando agregados a un tiempo t y c0 es la concentración de AH al inicio de la reacción. Un valor de α=0 ó α=1 indican que 0% o 100% del AH se encuentra formando agregados. Un gráfico α vs. t es llamado curva de agregación. La figura 2a muestra las curvas de agregación del AH a pH 5, obtenidas a diferentes concentraciones de Ca2+. Excepto para el caso de Ca2+ 0,8 mmol l-1, en todos los casos se observa que la agregación aumenta a medida que aumenta el tiempo y se detiene luego de aproximadamente 20 minutos de reacción. La fracción
agregada aumenta a medida que aumenta la concentración de Ca2+, llegando a una agregación casi completa (α aproximadamente 0,9) a concentraciones de Ca2+ de 2,4 mmol l-1 o mayores.

La velocidad de agregación del AH fue cuantificada a partir de la pendiente inicial de las curvas de la figura 2a. Los resultados se indican en la figura 2b, donde se grafica la velocidad de agregación como función de la concentración de Ca2+ a diferentes pH. Se puede observar que la velocidad de agregación es fuertemente dependiente de la concentración de Ca2+.

Figura 2. a) Curvas cinéticas de agregación de AH en presencia de Ca2+ a pH 5. b) Efecto del pH y la concentración de Ca2+ sobre la constante de velocidad.

Se identificó una concentración umbral de Ca2+ de alrededor de 1,5 mmol l-1, por debajo de la cual no hay un efecto significativo del Ca2+ sobre la velocidad de agregación. Concentraciones mayores a esta concentración umbral tuvieron un efecto significativo sobre la velocidad de agregación, la cual incrementó gradualmente con el aumento de la concentración de Ca2+. Esta concentración umbral es coincidente con el punto a partir del cual no se observa variación del ZP del AH en presencia de Ca2+.
Se observa también que la velocidad de agregación es notablemente mayor a pH 9 que a pH 5 y 7, lo cual podría asociarse al diferente grado de disociación de grupos reactivos del AH en función del pH.

Los resultados mostrados hasta ahora permiten postular un mecanismo de reacción de dos pasos, como se esquematiza a continuación:

La primera etapa es directamente la reacción de unión de Ca2+ a moléculas de AH. Si bien no se especifican las cargas eléctricas para mayor claridad, la unión de Ca2+ se produce a los grupos negativamente cargados del AH.

Esta unión es muy rápida, tal como se observó en experimentos cinéticos de ZP vs. t, y por lo tanto no es la etapa determinante de la velocidad de agregación, que ocurre más lentamente. Aunque la unión de Ca2+ al AH en esta primera etapa no alcanza a neutralizar la carga del AH, es suficiente como para que el ZP de las moléculas alcance valores por debajo del límite de estabilidad / inestabilidad permitiendo que tenga lugar la segunda etapa, donde ocurre verdaderamente la agregación de las moléculas de AH unidas al Ca2+. No se conoce hasta el presente qué es lo que determina que la agregación ocurra en tiempos de alrededor de 20 minutos, pero es posible que este proceso sea controlado por difusión. Las altas concentraciones de Ca2+ y altos valores de pH hacen que más cantidad de iones Ca2+ se unan a las moléculas de AH, lo que hace más eficiente y rápida la agregación en la segunda etapa. Además de neutralizar en parte las cargas del AH, los iones Ca2+ pueden favorecer la formación de puentes catiónicos entre diferentes moléculas de AH, lo que incrementa la agregación (Tipping, 2002).

Dada la complejidad y naturaleza polidispersa de los AH, es también importante investigar cuáles son las fracciones del AH que participan en la agregación. Este estudio se realizó a partir de la evaluación de la relación de absorbancia a 250 nm (E2) y a 365 nm (E3), denominada relación E2/E3, de las especies de AH que permanecían disueltas durante los estudios de cinética de agregación. La relación E2/E3 es inversamente proporcional a la presencia de especies poco condensadas, de bajo peso molecular.
Por lo tanto, si esta relación no varía a medida que ocurre la agregación no habría fraccionamiento de moléculas y los agregados tendrían la misma composición que las especies en solución. Si por el contrario, se observa una variación en la relación E2/E3, los resultados indicarían un fraccionamiento durante la agregación. La figura 3 muestra los datos de relación E2/E3 versus α para todas las concentraciones de Ca2+ y pH estudiados. La relación E2/E3 se mantiene aproximadamente constante hasta valores de α de aproximadamente 0,6, indicando que no hay fraccionamiento en estas condiciones. A mayores valores de α se observa un marcado incremento en la relación, indicando fraccionamiento de especies de AH, quedando en solución aquellas especies menos condesadas. Este hallazgo es coincidente con los resultados de Chilom et al. (2009) quien ha demostrado que los diferentes componentes del AH tienen diferentes contribuciones a la agregación de AH en solución, pero además indica que estos componentes disminuyen gradualmente su grado de aromaticidad durante el transcurso de la reacción.

Figura 3. Evolución de la relación E2/E3 versus α para todas las concentraciones de Ca2+ y pH estudiados.

 

 

CONICET, INQUISUR, INTA, UNS.