Asociación de ácidos orgánicos, bacillus subtilis y un oligosacárido manano en el control de Salmonella Minnesota en pollos de engorde

Introducción

Las salmonelosis representan un problema serio de salud pública tanto en los países en vías de desarrollo como en los desarrollados (Cardoso y Carvalho, 2006). Además, algunos serotipos de Salmonella poco diagnosticados en el pasado han aumentado en prevalencia y, actualmente, reprsentan un grave problema de salud pública (Shinohara et al., 2008). Este fenómeno también fue observado por Back (comunicación personal), que demostró un aumento en el número de serovares detectados a partir de muestras de ave. Entre estos nuevos serovares se encuentra Salmonella Minnesota. Con la intención de reducir los daños causados por esta bacteria, se ha venido efectuando investigaciones para encontrar nuevos productos que sean capaces de controlar a las enterobacterias y mejorar el desarrollo de las aves. El uso de ácidos orgánicos proporcionó un mejor rendimiento en las aves, mejor conversión alimenticia (Maiorka et al., 2004; Viola et al., 2008) mejor peso medio y mejor producción de huevos en gallinas ponedoras (Gama et al., 2000). Otra función atribuida a los ácidos orgánicos es la reducción en el conteo de Salmonella Enteritidis (Bassan et al., 2008). Según estos mismos autores, la combinación de ácidos orgánicos y oligosacáridos mananos (mananoligosacáridos, MOS) logra reducir de manera semejante y, en algunos casos, todavía más a la Salmonella Enteritidis. Otra alternativa para el control de la salmonelosis es el uso de probióticos, como el Bacillus subtilis, junto con oligosacáridos mananos. Esta combinación permitió lograr vellosidades de mayor altura y criptas de mayor profundidad en aves a los 21 días (Pelicano et al., 2005), posiblemente mejorando el rendimientode estas aves. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la eficiencia de la asociación de ácidos orgánicos, un oligosacárido manano como prebiótico y un probiótico a base de Bacillus subtilis en el control de Salmonella Minnesota.

Material y Métodos

Se utilizaron 60 pollos de engorde que se alojaron de los días 1 a 35° de edad, divididos en tres grupos, de acuerdo con el Cuadro 1. Los animales se mantuvieron en salas con presión negativa, desinfectadas y climatizadas a la temperatura ideal de confort para la edad de las aves. Se utilizó cama de viruta de madera esterilizada en autoclave, y el agua y el alimento se proporcionaron ad libitum. Antes del inicio del experimento, la cama y las raciones se realizaron en busca de la presencia de Salmonella spp. La dieta se formuló con niveles iguales superiores a los recomendados por el Consejo Nacional de Investigación (NRC) (1994) de EE. UU. Todos los alimentos se peletearon. A la llegada de los animales se practicó la eutanasia y la necropsia de cinco de ellos para recolectar el hígado y los ciegos, sometiéndolos a análisis para la presencia o ausencia de Salmonella. Todos los demás animales se pesaron individualmente para distribuirlos en forma homogénea, según su peso, entre los diferentes tratamientos (T) a los 15 días de edad las aves de los grupos T2 y T3 se inocularon una solución de SM a la concentración de 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml por vía oral. Se tomaron hisopos de cloaca 48 horas después de la inoculación, a razón de cinco muestras por tratamiento (conjunto o "pool" de 3 animales) para realizar el conteo de Salmonella. A los 35 días de edad, 10 animales por tratamiento se sacrificaron y se les practicó la necropsia para cosechar el buche y los ciegos, de manera aséptica y luego analizarlos en busca de Salmonella. A los 21 y 35 días de edad se tomaron cinco alícuotas de 10 g de cama de las salas donde se encontraban las aves (5 muestras por tratamiento) para análisis y conteo de Salmonella.

Cuadro 1. Descripción de los tratamientos

Tratamiento 1 (T1)	Alimento basal no inoculado con Salmonella Minnesota
Tratamiento 2 (T2)	Alimento basal inoculado con Salmonella Minnesota
Tratamiento 3 (T3)	Alimento basal con una mezcla de ácidos orgánicos (Neoacid^®), probiótico a base de Bacillus subtilis y oligosacáridos mananos, + inoculación con Salmonella Minnesota

Para realizar el procedimiento de conteo de Salmonella los hisopos cloacales, los buches, los ciegos y las muestras de cama se diluyeron en agua peptonada al 2% y se rediluyeron en tubos con agua peptonada al 0.1%, hasta lograr la concentración de 10^-3. Posteriormente, 100 μl de cada dilución se sembraron en placa, por duplicado, en medio agar xilosa lisina dexosicolato (XLD). Estas placas se incubaron en una estufa regulada a 35°C por 24 horas y posteriormente se sometieron a conteo de las colonias típicas (procedimiento adaptado de Desmidt et al., 1997). La solución inicial de agua peptonada al 2% se mantuvo a 35°C por 24 horas y, en caso de no obtener crecimiento de colonias típicas de Salmonella en las placas de XLD, se tomaron 100 μl de la solución inicial en agua peptonada al 2% que se depositaron en un tubo que contenía 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis, se incubó en una estufa regulada a 42°C por 24 horas, para confirmación. Cuando una muestra resultó negativa al conteo directo en gelosa XLD, pero positiva después del proceso utilizando medio de enriquecimiento y selectivo, la muestra se consideró positiva para el análisis estadístico. Los resultados del conteo de colonias se expresaron conforme los Procedimiento para el Conteo de Colonias (Procedimentos de Contagem de Colônia), Normativa No. 6, publicada el 26 de agosto de 2003 por el Ministerio de Agricultura, Pecuaria y Alimentación (MAPA, 2003). El conteo de colonias de Salmonella se transformó a Log 10 para el análisis estadístico mediante el sistema ANOVA, y la prueba de Fischer al 5% de probabilidad.

Resultados y Discusión

Las muestras de cama y alimento recolectadas antes de la llegada de las aves, las muestras de hígado y ciego recolectadas el primer día y las recolectadas en el grupo testigo negativo en los diversos períodos resultaron, todas ellas, negativas al análisis de Salmonella, demostrando el control bajo las condiciones experimentales.

Se observó una reducción del 29.83% en el conteo de SM, lo que representa un número de UFC estadísticamente inferior al del grupo testigo inoculado (T2) (Cuadro 2). En el conteo de cama y ciego a los 35 días se observaron reducciones de 40.00% 1 11.62%, respectivamente, en número de UFC de SM, en comparación con los testigos no inoculados (T2), lo que representa conteos estadísticamente diferentes en este grupo. En el conteo de las muestras de cama a los 21 días y de buche a los 35 días, la reducción de los conteos fue de 22.10% y 42.52%, respectivamente, sin diferencia estadísticamente significativa entre los grupos testigo inoculado y testigo inoculado tratado. De acuerdo con Byrd et al. (2001), la incorporación de ácido láctico en el agua de bebida es capaz de reducir la contaminación con Salmonella Enteritidis en el buche de los animales, antes del sacrificio. La administración de ácidos orgánicos en la ración de las aves ha demostrados ser especialmente efectiva en la reducción del conteo de Salmonella spp., pues esta bacteria es intolerante a los ácidos (Dibner y Buttin, 2002). Según Vilà et al. (2009) Bacillus cereus var Toyoi fue capaz de reducir el aislamiento de Salmonella Enteritidis en pollos de engorde y de mejorar su rendimiento zootécnico.

Cuadro 2. Conteo de colonias de Salmonella en los hisopos cloacales 48 horas después de la inoculación, de muestras de cama a los 21 y 35 días y de buche y ciegos a los 35 días, en los animales de los diferentes grupos, a los 35 días de edad (resultados expresados en Log10 UFC/g)

	*Log10, UFC de Salmonella* de acuerdo con la muestra y la edad de las aves**
Tratamiento	Hisopos 48h PI	Cama 21 días	Cama 35 días	Buche 35 días	Ciegos 35 días
Testigo (T1)	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a
*Salmonella* (T2)	3.95±2.24^c	4.30±0.07^b	3.60±0.22^c	0.87±0.50^b	4.30±4.28^c
*Salmonella* + Probiótico + ácido orgánico + prebiótico (T3)	2.07±1.47^b	3.35±1.32^b	2.16±1.00^b	0.50±0.74^b	3.80±1.61^b

^{Media ± desviación estándar. a,b,c Letras distintas en una misma columna son significativamente diferentes (P≤0.05).}

Conclusiones

La utilización de ácidos orgánicos combinados con probióticos y con un oligosacárido manano fue capaz de reducir de manera significativa, en compración con el grupo testigo inoculado (T2), el conteo de SM en los hisopos cloacalaes a las 48 horas después de la infección, y en la cama y los ciegos a los 35 días de vida. Con base en los resultados obtenidos, se concluye que la asociaicón de probiótico a base de B. cereus y un prebiótico a base de MOS, en combinación con ácidos orgánicos, es eficiente en la redución del conteo de SM, en pollos de engorde.

Bibliografía

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Byrd JA, Hargis BM, Caldwell DJ, Bailey RH, Herron KL, McReynolds JL, Brewer RL, Anderson RC, Bischoff KM, Callaway TR, Kubena LF. 2001. Effect of lactic acid administration in the drinking water during preslaughter feed withdrawal on Salmonella and Campylobacter contamination of broilers. Poult. Sci. 80:278-283.

Cardoso TG & Carvalho VM. 2006. Toxinfecção por Salmonella spp. Rev. Inst. Ciênc. Saude 24(2):95-101.

Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck F. 1997. Pathogenesis of Salmonella enteritidis phage type four after experimental infection of young chickens. Vet. Microbiol. 56(1-2):99-109.

Dibner JJ & Buttin P. 2002. Use of organic acids as a model to study the impact of gut microflora on nutrition and metabolism. J. Appl. Poult. Res. 11:453-463.

Gama NMSQ, de Oliveira MBC, Santin E, Berchieri Junior A. 2000. Ácidos orgânicos em rações de poedeiras comerciais. Ciênc. Rural 30(3):499-502.

Maiorka A, Santin AME, Borges SA, Opalinski M, Silva AVF. 2004. Emprego de uma mistura de ácidos fumárico, lático, cítrico e ascorbico em dietas iniciais de frangos de corte. Arc. Vet. Sci. 9(1):31-37.

MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). 2003. Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. Publicado no Diário Oficial da União de 18/09/2003. Seção 1, p.14. Brasil.

NRC (National Research Council). 1994. Nutrient requirements of poultry. National Academy Press, Washington, USA.

Pelicano ERL, Souza PA, Souza HBA, Figueiredo DF, Boiago MM, Carvalho SR, Bordon VF. 2005. Intestinal mucosa development in broiler chickens fed natural growth promoters. Braz J Poult. Sci. 7(4):221-229.

Shinohara NKS, de Barros VB, Jimenes SMC, Machado ECL, Dutra RAF, Filho JLL. 2008. Salmonella spp., importante agente patogênico veiculado em alimentos. Ciênc. Saúde Coletiva 13(5):1675-1681.

Vilà B, Fontgibell A, Badiola I, Esteve-garcia E, Jimenez G, Castillo M, Brufau J. 2009. Reduction of Salmonella enterica var. Enteritidis colonization and invasion by Bacillus cereus var. toyoi inclusion in poultry feeds. Poult. Sci. 88:975-979

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Introducción

Material y Métodos

Cuadro 1. Descripción de los tratamientos

Tratamiento 1 (T1)	Alimento basal no inoculado con Salmonella Minnesota
Tratamiento 2 (T2)	Alimento basal inoculado con Salmonella Minnesota
Tratamiento 3 (T3)	Alimento basal con una mezcla de ácidos orgánicos (Neoacid^®), probiótico a base de Bacillus subtilis y oligosacáridos mananos, + inoculación con Salmonella Minnesota

Resultados y Discusión

	*Log10, UFC de Salmonella* de acuerdo con la muestra y la edad de las aves**
Tratamiento	Hisopos 48h PI	Cama 21 días	Cama 35 días	Buche 35 días	Ciegos 35 días
Testigo (T1)	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a	0.00±0.00^a
*Salmonella* (T2)	3.95±2.24^c	4.30±0.07^b	3.60±0.22^c	0.87±0.50^b	4.30±4.28^c
*Salmonella* + Probiótico + ácido orgánico + prebiótico (T3)	2.07±1.47^b	3.35±1.32^b	2.16±1.00^b	0.50±0.74^b	3.80±1.61^b

^{Media ± desviación estándar. a,b,c Letras distintas en una misma columna son significativamente diferentes (P≤0.05).}

Conclusiones

Bibliografía

Cardoso TG & Carvalho VM. 2006. Toxinfecção por Salmonella spp. Rev. Inst. Ciênc. Saude 24(2):95-101.

Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck F. 1997. Pathogenesis of Salmonella enteritidis phage type four after experimental infection of young chickens. Vet. Microbiol. 56(1-2):99-109.

Dibner JJ & Buttin P. 2002. Use of organic acids as a model to study the impact of gut microflora on nutrition and metabolism. J. Appl. Poult. Res. 11:453-463.

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Shinohara NKS, de Barros VB, Jimenes SMC, Machado ECL, Dutra RAF, Filho JLL. 2008. Salmonella spp., importante agente patogênico veiculado em alimentos. Ciênc. Saúde Coletiva 13(5):1675-1681.

Asociación de ácidos orgánicos, bacillus subtilis y un oligosacárido manano en el control de Salmonella Minnesota en pollos de engorde

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