Efecto del ozono sobre el crecimiento de bacterias y hongos de importancia avicola

Introducción

El gas ozono no es más que oxígeno que ha sido impactado por una descarga eléctrica y el impacto de la descarga el oxígeno sufre una reagrupación tri-atómica. Debido a su reactividad regresa al estado de oxigeno rápidamente (Rubin, 2001). El uso del ozono se incrementó en los últimos años en el mundo entero, ante la preocupación cada día más del uso perjudicial de químicos como desinfectantes. Se conoce que este gas introducido en un ambiente realiza cuatro acciones fundamentales: microbicida, desodorante, oxidante y descontaminante. Debido a su altísimo poder oxidante y desinfectante comenzó a usarse en el mundo para una gran cantidad de aplicaciones enfocadas al tratamiento de aguas, aires y eliminación de olores, como así también poco a poco fue ganando terreno sobre su aplicación en el bienestar humano, de la flora y fauna (Ricaurte Galindo, 2006).

Su aplicación tiene grandes ventajas en el medio ambiente ya que en dosis pequeñas no tiene efectos secundarios, por lo tanto no contamina, siendo un poderoso agente sanitizante. El ozono puede reducir y limitar el uso tradicional de químicos usados para la desinfección, agregar una barrera más eficaz contra la contaminación como un esterilizador y desinfectante para ganar eficacia y eficiencia. Comparado con los productos clorados, el ozono ofrece muchas ventajas al ser utilizado en cualquiera proceso de producción de alimentos. También se encuentran grandes ventajas si las necesidades que se requieran implican el lavado, sanitización y desinfección de productos, materiales, superficies, instrumentos, maquinarias, tuberías, contenedores, prácticamente cualquier área o superficie (Ricaurte Galindo, 2006). Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la acción antimicrobiana del ozono frente a hongos y bacterias de importancia en avicultura.

Materiales & Métodos

Microorganismos y condiciones de cultivo
Se utilizaron 5 cepas de Aspergillus (4 Aspergillus fumigatus y 1 Aspergillus oryzae) y 5 cepas de Salmonella pertenecientes a distintos serovares. Todas pertenecían a la colección del Laboratorio de Sanidad Aviar de la EEA INTA Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina.

Las cepas fúngicas, aisladas de pulmón de aves comerciales o de material de cama para uso avícola, fueron identificadas de acuerdo a lo propuesto por Pitt & Hocking (1997) y Klich (2002). Las mismas fueron mantenidas a 4ºC en agar papa glucosado (APG, Merck, Alemania) en pico de flauta e incubadas a 25 ± 2ºC durante 7 días. Las esporas fúngicas fueron recogidas con una solución acuosa de Tween 80 al 0,05% (v/v). El recuento de conidios fue realizado empleando una cámara cuentaglóbulos (hemocitómetro), estandarizando la suspensión a una concentración final de aproximadamente 10⁶ conidios/ml.

Las cepas de Salmonella fueron obtenidas de aislamientos de clara-yema, maple o hisopado cloacal de aves, tipificados según el esquema de Kauffmann- White por el Servicio de Enterobacteria del Instituto Malbrán (Buenos Aires, Argentina). Estas bacterias fueron mantenidas a 4ºC en caldo tripteína soja (CTS, Acumedia, Estados Unidos). Los cultivos de trabajo fueron obtenidos por siembra en agar tripteína-soja (ATS, Acumedia, Estados Unidos), luego se tomó una colonia y se la sembró en CTS, se incubó durante 8 hs a 35 ± 2ºC. Finalmente, los cultivos fueron incubados en el mismo medio durante 12-16 horas hasta obtener una concentración final de 10⁸-10⁹ Unidad Formadora de Colonia (UFC)/ml.

Equipo generador de ozono
Se utilizó un equipo de la empresa BUILTEC que generaba 60g/h de ozono con un consumo de lámpara de 15 W y una potencia de 2600 V.

Ensayo de inhibición en medio agarizado
Para el caso de los hongos, a partir de la suspensión de 10⁶ conidios/ml se realizaron diluciones sucesivas hasta 10³conidios /ml. Se tomaron 0,1 ml de esta última y se sembraron en superficie con espátula de Drigalsky en agar Czapek-Dox modificado (Oxoid, Inglaterra) con el agregado de extracto de levadura (Merck, Francia) al 0,5%. El ozono fue inoculado a diferentes tiempos (5, 10, 15 y 20 minutos) través de un orificio (realizado en esterilidad) en la superficie de las placas de Petri. Se utilizó un control con la siembra del hongo (tiempo 0). Las diferentes colonias obtenidas a los 5 días de incubación a 25 ± 2ºC, fueron contadas y expresadas como UFC/placa. Para el caso de las bacterias, el cultivo original fue diluido hasta 10³ UFC/ml y se sembró 0,1 ml de esta última en superficie con espátula de Drigalsky en ATS (Acumedia, Estados Unidos) y agar Mac Conkey (MC, Merck, Alemania). Luego, el ozono fue aplicado directamente sobre la placa con el medio y la siembra de la misma manera y en los mismos tiempos que para el caso de los hongos. También, se incluyó un control sin ozono con la siembra de la bacteria (tiempo 0). Posteriormente, las placas fueron incubadas a 35 ± 2 ºC durante 24 hs y luego las colonias bacterianas enumeradas en cada placa y expresadas como UFC/placa.

Análisis estadístico
Los resultados fueron informados como la media ± el desvío estándar de la misma. El número de conidios de hongos ó las colonias bacterias por placa de Petri fue analizado con el test de ANOVA balanceado. Las medias que mostraron diferencias significativas fueron comparadas usando el test de Tukey (Minitab Student R12). Todos los valores de significancia estadística están basados en un nivel de probabilidad de 0,05 (Rossman & Chance, 1998). Los ensayos fueron realizados por triplicado.

Resultados & Discusión

El efecto del tiempo de exposición al ozono dependió de la cepa estudiada, aunque los hongos resultaron ser más resistentes que las bacterias. En referencia a los primeros (Tabla 1), el ozono disminuyó el número de esporas en la cepa B0122 desde 19% a 72% respecto al control, en la cepa E0093-72 desde 29 a 91%, en la cepa C0131 desde 24 a 68%, en la cepa J2(-4)2 desde 11% a 62% y en la cepa E0093-70 desde 69% a 87%. En 2 de las 5 cepas fúngicas utilizadas (cepas C0131 y J2(-4)2) 5 minutos de exposición con ozono fueron suficientes para disminuir estadísticamente el número de esporas de estos hongos, respecto al control. En las tres cepas restantes se necesitó la exposición de ozono por un mínimo de 10 minutos. En la mayoría de los hongos ensayados no se observó diferencia estadística en la disminución de las esporas fúngicas a partir de los 10 minutos de exposición al ozono. Por otro lado, la cantidad de esporas viables respecto a las totales dependió de la cepa estudiada y estuvo entre 38,5 (cepa E0093-72) a 72% (cepa J2(-4)2).

Tabla 1. Efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Aspergillus de importancia en avicultura

Cepa	UFC totales inoculados	UFC/placa según el tiempo de exposición al ozono (en minutos)
0´	5´	10´	15´	20´
*A. fumigatus* B0122	212 ± 9*	146 ± 21^A	118 ± 15^AB	79 ± 12^BC	40 ± 7^C	41 ± 22^C
*A. fumigatus* E0093-72	200 ± 29*	77 ± 29^A	55 ± 16^AB	28 ± 16^BC	14 ± 4^BC	7 ± 3^C
*A. fumigatus* C0131	296 ± 19*	189 ± 17^A	143 ± 15^B	140 ± 7^B	88 ± 9^C	61 ± 12^C
*A. fumigatus* J 2 (-4) 2 (C0153)	322± 12*	232 ± 17^A	207± 4^AB	167 ± 15^B	104 ± 14^C	89 ± 19^C
*A. oryzae* E0093-70	296± 19*	137 ± 51^A	43 ± 18^B	42 ± 31^B	29 ± 13^B	18 ± 6^B

^{A, B, C Medias con diferentes letras en la misma fila difieren significativamente (P<0,05).}

La Tabla 2 muestra el efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Salmonelas ensayadas. S. Orion resultó ser más resistente al efecto al tiempo de exposición del ozono en TSA. Sin embargo, S. Agona mostró más resistencia al efecto del ozono en MC (datos no mostrados). A partir de los 5 minutos de exposición se presentó una importante disminución de la carga bacteriana y a partir de los 10 minutos la disminución llegó a un 100% en casi todas las cepas. Por otro lado, aunque la carga bacteriana en ATS fue inicialmente mayor respecto a lo crecido en MC (datos no mostrados), se observó una disminución importante con la aplicación del ozono. Esta carga mayor inicial puede ser explicada por la presencia de células dañadas de Salmonella que no crezcan en agar Mac Conkey, pero si en ATS.
Vijayanandraj et al. (2006) informaron que el ozono produjo la formación de micelio estéril en Aspergillus niger, que falló para producir esporas. Otros autores describen un efecto similar sobre otras cepas de Aspergillus (Antony-Babu & Singleton, 2009). Estos resultados concuerdan con lo encontrado en nuestros ensayos. Por otro lado, se ha informado la acción del ozono sobre distintas bacterias en el agua (Lescano et al., 1999; Restaino et al., 1995) y poco se ha investigado sobre la acción de este gas sobre Salmonelas de importancia avícola.

Tabla 2. Efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Salmonelas de importancia en avicultura

Tiempo Ozono (minutos)	Cepas bacterianas y número de UFC/placa en agar tripteína soja (TSA)
ST¹	SG²	SE³	SO⁴	SA⁵
0	39 ± 3^A	97 ± 9^A	75 ± 7^A	103 ± 5^A	122 ± 16^A
5	2 ± 2^B	1 ± 1^B	0 ± 0^B	14 ± 9^B	1 ± 1^B
10	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^C	4 ± 1^B
15	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^C	1 ± 1^B
20	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^B	0 ± 0^C	1 ± 1^B

^{A, B, C Medias con diferentes letras en la misma columna difieren significativamente (P<0,05). 1 Salmonella Typhimurium CUB 01/10, 2 Salmonella gallinarum CUB 05/10, 3 Salmonella Enteritidis CUB 06/10, 4 Salmonella Orion CUB 28/08, 5 Salmonella Agona CUB 07/10.}

Conclusiones

La aplicación de ozono por un mínimo de 5 minutos (5 g) y de 10 minutos (10 g) es útil para disminuir de manera importante la cantidad de Salmonelas y Aspergillus sp. crecidos en medios de cultivos, respectivamente. Estos resultados resultan alentadores para estudiar el efecto del ozono sobre ambientes avícolas, donde pueden estar presentes los microorganismos nombrados anteriormente.

Efecto del ozono sobre el crecimiento de bacterias y hongos de importancia avicola

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