Desarrollo de una bacterina para la prevención de la colibacilosis aviar a partir de cepas mexicanas de escherichia coli invasivas extraintestinales (exiec)”

Las cepas patógenas para aves se clasifican dentro del grupo APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli)1-7, las cuales pueden actuar como agente causal, o bien, como patógeno secundario en enfermedades inmunodepresoras o del tracto respiratorio. La Colibacilosis aviar es una enfermedad de importancia económica para la industria avícola, ya que se manifiesta como una infección localizada o generalizada. Es causada por Escherichia coli, cuya patogenia depende de la virulencia de la cepa, estado del hospedero y factores ambientales. La manifestación más severa de la colibacilosis aviar es la septicemia (colisepticemia) que ocurre frecuentemente en parvadas afectadas junto con otras infecciones respiratorias; se cree que E. coli puede actuar como patógeno oportunista después de la acción de Mycoplasma gallisepticum o de virus como el de la bronquitis infecciosa o Laringotraqueítis8,9; sin embargo, la celulitis y otras lesiones causadas por E. coli han sido reproducidas experimentalmente en pollos sin la participación de otro agente10,11. Aunque la patogénesis de la colibacilosis es poca entendida, el desarrollo de una bacteremia parece ser esencial 12,13. Actualmente, la manera de controlar estas infecciones es mediante el empleo de antimicrobianos. Sin embargo, estos tratamientos representan un costo muy elevado y tienen repercusiones importantes en la selección de bacterias resistentes, lo que a la postre, ocasiona un problema mayor. Lo anterior ha dado lugar a que resurja el interés para el desarrollo de métodos alternativos para la protección de las aves contra estas infecciones. Como es el caso de las vacunas con bacterias muertas, o bacterinas, que son preparaciones del agente patógeno que se ha hecho inofensivo debido a la inactivación de sus proteínas por medios químicos o físicos. Éstas tienen la ventaja de inducir un buen nivel de inmunidad humoral (si se aplican dosis de refuerzo), no existen posibilidades de mutación,  recombinación o reversión a la virulencia; además de que se pueden usar en animales inmunodeprimidos.

Existen antecedentes del desarrollo de bacterinas efectivas contra varios serotipos de E. coli, como O2:K1 y O78:K80 14-16, que proveen protección contra serogrupos homólogos, pero no una protección cruzada significativa contra serogrupos heterólogos 17. En consecuencia, para lograr una vacunación satisfactoria es necesario inmunizar con las cepas bacterianas específicas de un brote o por la frecuencia de aislamiento del microorganismo; por lo que el empleo de bacterinas polivalentes elaboradas a partir de mezclas de distintos tipos antigénicos representa la alternativa más segura para lograr un mayor margen de protección18. Por ello, es importante contar con estudios epidemiológicos que permitan identificar los serogrupos más frecuentes de cada región donde se desea utilizar la bacterina.

Implementar sistemas de protección que permitan disminuir los procesos infecciosos ocasionados por E. coli en aves resulta de gran importancia por el enorme impacto económico que dichas infecciones representan. En el presente trabajo, se plantea el desarrollo de una bacterina polivalente elaborada con algunos de los serogrupos de mayor incidencia en las infecciones de aves en México. El empleo de una bacterina polivalente con los serogrupos O2, O78 y O84 de Escherichia coli que se han identificado comúnmente en México permitirá inducir una respuesta inmune contra estos microorganismos y protegerá a las aves de infecciones ocasionadas por el grupo APEC. Desarrollar una bacterina polivalente con cepas APEC que se identifican frecuentemente en el campo mexicano, que sea inocua, estimule una buena producción de anticuerpos y que estos tengan actividad protectora contra los serogrupos utilizados; lo que permitirá proteger a las aves inmunizadas, disminuir la mortalidad de las aves, y en consecuencia, los costos relacionados a infecciones por APEC.

Cepas Bacterianas. Se confirmó la identidad mediante pruebas bioquímicas de 76 cepas de E. coli aisladas en un estudio previo a partir de granjas de reproductoras, incubadora y pollo de engorda19 y la tipificación serológica se realizó de acuerdo al procedimiento empleado en el Laboratorio de Bacteriología del Departamento de Salud Pública, de la Facultad de Medicina de la UNAM de acuerdo con Orskov y Orskov20, mediante la utilización de sueros específicos (SERUNAM) que fueron obtenidos de conejo Nueva Zelanda blanco. Se seleccionaron los serogrupos O2, O78 y O84, los criterios de selección fueron: porcentaje de letalidad embrionaria determinado en el estudio de Ramírez et al. (2009)²¹ y los serogrupos identificados más frecuentemente en el estudio de Rosario et al. (2005)¹⁹. 

Elaboración de la bacterina polivalente de E. coli. La concentración bacteriana de cada serogrupo se ajustó mediante la medición de absorbancia con un espectrofotómetro, las bacterias presentes en la suspensión se mezclaron e inactivaron mediante calentamiento a 80°C por 1h. Una vez homogeneizadas, se llenaron alícuotas con 2 ml (1x108 bacterias/ml), se congelaron a -80°C por 3h y posteriormente se liofilizaron. Para preparar el producto final, las pastillas obtenidas se hidrataron con 2 ml de SSF, y se adicionó igual cantidad de hidróxido de aluminio (1:1); es decir, la bacterina para su aplicación contenía una concentración de 1x107 UFC por dosis de 0.1 ml, aproximadamente. 

Inmunización de pollos libres de patógenos específicos (SPF). Se alojaron 74 pollos SPF de un día de edad y se formaron dos grupos: el experimental con 42 pollos SPF, los cuales fueron inmunizados con 0.1 ml de la bacterina que contenía aproximadamente 1x107 UFC por dosis por vía subcutánea en el tercio medio del cuello; mientras que el grupo testigo, formado por 32 pollos SPF, sólo recibieron 0.1 ml de SSF estéril. Antes de aplicar los tratamientos, se tomaron muestras de sangre (1 día de edad) de todos los pollos (200 μl aproximadamente). 

Evaluación de niveles de anticuerpos en suero de pollos preinmunes e inmunes. Esta se realizó contra los tres lipopolisacáridos de manera individual (O2, O78 y O84). Se analizaron los sueros de todos los pollos al día de edad (preinmunes), y después de la inmunización con la bacterina y de los que recibieron SSF (Testigo) durante 7 semanas. Para esto, se empleó la técnica de ELISA descrita anteriormente en el XXXV convención anual ANECA 2010 con algunas modificaciones²².

Inmunotransferencia con sueros de pollos preinmunes e inmunes. Para evaluar los perfiles antigénicos reconocidos por los anticuerpos IgY anti-LPS O2, O78 y O84 de E. coli, los extractos de LPS fueron separados por SDS-PAGE y después se llevó a cabo la inmunotransferencia usando el mismo procedimiento descrito anteriormente ²²,. Para este ensayo se utilizaron cuatro sueros; un suero preinmune, y tres sueros de las semanas 1, 6 y 7 respectivamente, estos se evaluaron previamente mediante el ensayo de ELISA. 

Ensayo de actividad bactericida del suero. Dado que en México el complemento aviar no está disponible comercialmente, se decidió utilizar un modelo descrito por Orhan et al. (2001)24; para ello, se utilizó suero obtenido de 3 gallinas adultas (DPA:Aves), estos deben estar libres de anticuerpos contra los antígenos usados. Para determinar la presencia de anticuerpos específicos en los sueros las muestras se analizaron mediante una inmunotransferencia con los diferentes LPS descrita anteriormente con algunas modificaciones, los sueros de las aves se utilizaron a una dilución 1:50, y un anticuerpo secundario de conejo anti-IgY de pollo conjugado con fosfatasa alcalina (Invitrogen) en una dilución 1:1000.

Selección de cepas para la elaboración de la bacterina. Los serogrupos O2, O78 y O84 fueron los que presentaron las frecuencias más altas (Cuadro 1). Por otro lado en un trabajo sobre letalidad embrionaria realizado en un estudio paralelo a éste, con el lote de cepas previamente referido, se observó que las cepas de los serogrupos O2, O78 y O84 mostraron índices de letalidad embrionaria que los clasificó como virulentos (Cuadro 2). Por tal motivo, se consideró que estos serogrupos cubrían los requisitos para ser utilizados en el desarrollo de la bacterina.

Evaluación de los niveles de anticuerpos de pollos SPF previos a la aplicación de la bacterina. Se consideró que una respuesta era positiva cuando la lectura del ensayo de ELISA era ≥ a 0.2 DO. El 84% de los sueros  mostraron reacción positiva contra O2, 61% contra O78 y 82% con O84. Otra observación consistió en que la respuesta contra O2 presentó un promedio de lecturas de DO más altas que contra los otros dos LPS analizados (Figura 1). Los 74 animales fueron separados en dos grupos, el experimental (n=42), al que se le  administró la bacterina y el testigo (n=32) a los que únicamente se les inoculó SSF estéril. 

Inmunogenicidad inducida por la bacterina. En la primera semana post-inoculación el 81% de los pollos del grupo experimental mantenían una respuesta positiva contra O2, 50% contra O78 y 57% contra O84. Con relación al grupo testigo sin inocular, se observó que los sueros de todos los pollos presentaban una respuesta positiva contra O2, 75% contra O78 y 62.5% contra O84. En la segunda semana el número de sueros con respuesta positiva contra O78 y O84 disminuyó considerablemente en los dos grupos de pollos, mientras que O2, aunque se presentó disminución en el número de sueros positivos, ésta se mantuvo tanto en los de pollos inmunizados (52%) como en los del grupo testigo (66%) (Cuadro 3).

Dado que en avicultura se analiza la inmunidad de parvada mediante la determinación del promedio en las lecturas del ELISA del total de aves, se decidió hacer este tipo de análisis con lo que se pudo observar que la respuesta de anticuerpos contra O2, se mantiene positiva hasta la segunda semana y media de edad (18 días) y con lecturas negativas a partir de la semana 3, 4 y 5 en ambos grupos. A partir de  la semana 6 se observó respuesta positiva con lectura de 0.23 y a la semana 7 con 0.38 DO en el grupo experimental (figura 1).

Por su parte, la respuesta contra los LPS O78 y O84 mostró lectura positiva de ambos grupos durante la primera semana y media de edad (Figura 4 y 5), la respuesta contra O78 dio resultados negativos a partir de la semana 2, los cuales se mantuvieron igual en los dos grupos de pollos hasta concluir el estudio a la semana 7 (Figura 2). Con relación a la respuesta de los sueros contra O84, en ambos grupos los resultados fueron negativos las semanas 2 y 3, mientras que a partir de la semana 4, y hasta la séptima semana, se observaron resultados positivos solo en el grupo experimental (Figura 3). Durante la fase experimental no hubo mortalidad; adicionalmente, ninguno de los 42 pollos inmunizados mostró reacciones adversas atribuibles a la bacterina.

Especificidad antigénica de anticuerpos anti- LPS en suero. Para conocer que fracción de los LPS son reconocidos por los anticuerpos de los pollos, se realizó un ensayo de inmunotransferencia. Para esto, fue seleccionado un suero obtenido antes de la inmunización el cual mostró reacción positiva en la prueba de ELISA contra los 3 LPS, adicionalmente, se enfrentaron 3 sueros, de la semanas 1, 6 y 7 de animales inmunizados, todos contra los tres LPS. En la inmunotransferencia se confirmó que el suero pre-inmune reaccionó contra los diferentes componentes de los tres diferentes LPS. La respuesta contra O78 sólo fue positiva en el suero pre-inmune, mientras que con O2 se observó reactividad con los sueros de las semanas 1, 6 y 7; con O84, sólo se apreció en las aves de las semanas 6 y 7 (Figura 4).

Ensayo de actividad bactericida del suero. Para evaluar si los anticuerpos generados por la bacterina eran de tipo protector se realizó un ensayo de actividad bactericida. Debido a que no se contó con complemento aviar  comercial, para realizar el ensayo se siguió un modelo descrito por otros autores, quienes utilizan como fuente de complemento, suero de pollos libres de anticuerpos contra el antígeno en estudio. Para corroborar que los sueros de tres gallinas utilizadas en esta fase del trabajo estaban libres de anticuerpos contra los serogrupos O2, O78 y O84, se analizaron estos mediante un ensayo de inmunotransferencia utilizando los tres diferentes LPS. El resultado mostró que los sueros reaccionaban con los LPS O2 y O84 (Figura 5). Ya que no fue posible obtener suero libre de anticuerpos anti O2 y anti O84 se decidió eliminar estos mediante absorción con los antígenos referidos. Después de la absorción se hizo el ensayo de actividad bactericida para determinar la presencia del complemento; sin embargo, el resultado fue negativo, ya que al parecer, el complemento se inactivó durante el procedimiento de absorción. Lo anterior se concluyó ya que en otro ensayo con el suero que no fue absorbido se observó actividad bactericida contra E. coli O84. Por otro lado, para determinar si el suero de gallina por sí solo inducía la actividad bactericida, se llevó a cabo otro ensayo en el que se enfrentaron el suero de gallina sin absorber más bacterias, un suero de pollo positivo calentado más bacterias y un suero de pollo positivo sin calentar más bacterias; en este ensayo se observó actividad bactericida únicamente con el suero de gallina sin absorber.

En trabajos realizados por Melamed et al. (1991)²⁵ y Kwaga et al. (1994)²⁶, sugieren la conveniencia de elaborar una vacuna que contenga los serogrupos más comunes asociados a la colibacilosis aviar. Es por ello que en el presente trabajo se propuso el desarrollo de una bacterina polivalente con los serogrupos O2 O78 y O84, los cuales, además de haberse identificado como los más comunes tanto en México ^21,27, como en otros países ^17,28,29, poseían genes de virulencia y causaron un porcentaje de letalidad embrionaria entre 60 y 80%, que permitió clasificarlos como virulentos en un estudio realizado por Ramírez et al. (2009)²¹.

En el análisis de sueros de los pollos antes de la administración de la bacterina, se observó que la mayoría de los sueros reaccionaban contra los tres diferentes LPS de los serogrupos bacterianos empleados en la elaboración del inmunógeno (O2: 84%, O78: 61%, O84: 82%). Además, al calcular el promedio de las lecturas de DO de los sueros de los 74 pollos, se pudo observar que la respuesta contra O2 (1.04 DO) fue superior a la observada contra O78 (0.35 DO) y O84 (0.46 DO). Este hallazgo pudo deberse a la presencia de una infección previa en las reproductoras que indujo la respuesta inmune contra las bacterias causantes y que los anticuerpos hayan sido transferidos a la progenie, de acuerdo a lo reportado por Brambel (1970)30, quien fue uno de los primeros en reportar que las aves reproductoras transfieren inmunidad materna a su progenie; estudios más recientes llevados a cabo por Loeken et al. (1983)³¹ y Al-Natour et al. (2004)³², determinaron que, la cantidad de IgY transferida al vitelo del huevo es proporcional o incluso mayor a la concentración de IgY maternal en suero. En un estudio realizado por Yoshiharu et al. (1987)³³ demostraron que la protección transferida de reproductoras vacunadas a su progenie dura hasta los 21 días después de la eclosión. En este estudio, al hacer el análisis de los sueros se observó que las respuestas positivas en los sueros del primer día de edad (pre-inmunes), se mantienen positivos hasta los 11 días edad contra los serogrupos O78 y O84 y hasta los 18 días de edad contra O2, a pesar de que las madres, por ser SPF, no son vacunadas. Estos resultados sugieren que estas respuestas pudieran corresponder a los anticuerpos maternos transferidos por las reproductoras.

Para evaluar la capacidad inmunogénica de la bacterina inoculada en pollos de un día de edad, como se mencionó previamente, se analizaron los sueros de pollos hasta la séptima semana. En esta fase del estudio se pudo observar el poco y retardado estímulo inducido por la bacterina, lo que se atribuye a la temprana edad de los pollos al momento de la inmunización como lo señalan Trampel et al. (1997)¹⁴ y Frommer et al. (1994)³⁴. Una posible explicación a lo antes referido pudiera ser que la presencia de anticuerpos transferidos por la madre contra los tres LPS, inhiben la respuesta inmune al reaccionar con los antígenos de la bacterina, tal y como ha sido referido por Heller et al. (1990)³⁵. 

Lo anterior se puede sugerir con base a los resultados en la respuesta de anticuerpos en suero de pollos del grupo experimental (bacterina) obtenidos en este trabajo, en el que la respuesta de anticuerpos maternos registraron la media más alta (0.86 DO) contra el serogrupo O2, el cual se mantuvo positivo hasta los 18 días, y la respuesta a la  inmunización se presentó hasta la semana 6 sólo en el grupo experimental. A diferencia de lo observado contra el serogrupo O84 en el que la media de títulos de anticuerpos maternos son más bajos (0.43 DO), y desaparecen a los 11 días de edad, por lo que la respuesta a la inmunización fue evidente a partir de la semana 4 y se mantuvo positivo hasta la semana 7 y con títulos más altos que los generados contra el serogrupo O2, sólo en el grupo experimental. Es decir, a mayor título de anticuerpos maternos, la respuesta a la bacterina se retarda y los títulos de anticuerpos generados por esta son más bajos. En cuanto al serogrupo O78 a pesar de que la media en los títulos de anticuerpos maternos (0.29 DO) fueron aun más bajos que contra O84, este no estimuló respuesta alguna, manteniendo títulos negativos en los dos grupos de pollos a partir de la semana 2 hasta completar el experimento. Los resultados anteriores coinciden con lo reportado por Heller et al. (1990)35 quienes señalan que a mayor respuesta de anticuerpos maternos el estímulo de la bacterina se retarda, ya que la respuesta contra O2 aparece dos semanas después de O84. Con estos datos, se considera factible que la baja respuesta observada podría estar relacionada con la neutralización inicial del inmunógeno administrado; ya que posteriormente, se presenta una reactivación en la respuesta en los animales inmunizados. Melamed et al. (1991)25 y Deb et al, (1976,
1978)15,16 inmunizaron aves con una bacterina después de la segunda semana de edad y sus resultados fueron favorables en cuanto a protección contra cepas homólogas. Lo antes expuesto plantea la posibilidad de utilizar la bacterina a partir de la segunda o tercer semana de edad cuando no hay presencia de anticuerpos maternos contra los LPS seleccionados. 

Los resultados obtenidos contra O78 fueron interesantes, ya que al igual que O2 y O84 fue uno de los serogrupos identificados con más frecuencia; sin embargo, la respuesta de anticuerpos antes de la inmunización fue la más baja de todas; adicionalmente, no se observó respuesta posterior a la administración de la bacterina. Por su parte, Deb et al. (1976)15 elaboraron una bacterina contra O78 adsorbida en hidróxido de aluminio y demostraron que la protección no se relacionó con la producción de aglutininas anti O y K en suero, lo que sugiere que la respuesta inmune generada no va dirigida contra el LPS O78. Por ello, los resultados del presente trabajo pudieran deberse a que la respuesta contra O78 va dirigida hacia otros componentes de superficie de la bacteria. Al respecto, un estudio realizado por Abdul-Aziz et al. (1998)36, muestra que la inmunización activa y pasiva con una cepa  rugosa de E. coli (J5) protege contra la infección por O78. Estos autores sugieren que, probablemente, la respuesta va dirigida contra el core, lo que podría explicar la respuesta observada por ELISA y en el ensayo de inmunotransferencia contra el LPS. Sin embargo, si bien, sólo se observó reacción de los anticuerpos contra O78 en los animales antes de la aplicación de la bacterina, no se puede asegurar que no hubo respuesta inmune contra los serogrupos empleados en la bacterina ya que no se realizaron ensayos de protección (desafío). Por tal motivo resulta conveniente elaborar una bacterina exclusivamente contra O78 y medir la respuesta inmune tanto humoral (contra otros componentes de superficie bacteriana) como celular para definir los factores que pudieran estar involucrados en la protección.

El ensayo de inmunotransferencia se realizó para evaluar la respuesta cualitativa de los sueros de diferentes semanas. Los resultados fueron similares a los obtenidos en el ensayo de ELISA, ya que los sueros pre-inmunes reaccionaron contra los tres LPS, mientras que contra O78 fue de menor intensidad (Figura 4A). Uno de los sueros a la primera semana posterior a la inoculación de la bacterina mostró reactividad únicamente contra el LPS O2. Así mismo los sueros de las semanas 6 y 7 sólo reaccionaron contra los LPS O2 y O84. Los resultados anteriores correlacionan con el ensayo de ELISA, lo que indica que la respuesta contra O78 inducida por la bacterina no va dirigida contra el LPS O78, tal y como se demostró en los dos ensayos.

Aunque los resultados obtenidos muestran que se indujo respuesta contra los LPS O2 y O84, no se evaluó si ésta era de tipo protector, ya que el ensayo de actividad bactericida del suero no se realizó de manera conveniente, debido la IgY no activa al complemento mamífero37 y no se contó con complemento aviar.

Los resultados obtenidos muestran que la bacterina utilizada fue capaz de inducir una respuesta inmune humoral; sin embargo, es importante que en futuros estudios la bacterina se aplique una vez que los títulos de anticuerpos maternos no interfieran con ella; de igual manera, se sugiere hacer desafíos para evaluar la protección de este inmunógeno. Por ello, también debe considerarse la aplicación en reproductoras para incrementar los títulos de anticuerpos que se transfieren a la progenie, y de este modo, protegerlos durante las primeras 3 a 4 semanas, cuando el pollito es más susceptible a las infecciones causadas por E. coli. Aunque la producción de anticuerpos fue baja, y no se probó directamente la correlación entre la producción de anticuerpos y protección, los anticuerpos pueden jugar un papel importante en el control de la colibacilosis aviar 55 ya que pueden impedir la colonización, o bien, contribuir a la destrucción de la bacteria mediante fagocitosis post-opsonización o activando al sistema del complemento.

 

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