Variables PK/pd mejoradas de la enrofloxacina en pollo de engorda mediante el uso de perlas de alginato

Introducción
La OMS ha instado al mundo a hacer un uso racional de los antibacterianos en todos los ámbitos del quehacer humano [1] y consecuentemente el mundo de la producción veterinaria no está exenta de cuidar esta recomendación [2] . En particular en la avicultura se ha revelado que se tiene que realizar una importante labor de investigación para optimizar su uso en la clínica y en particular para generar preparados farmacéuticos que alcancen las variables farmacocinéticas/farmacodinámicas (PK/PD) idóneas que requiere cada principio activo [3]. Por ejemplo, la enrofloxacina, un antibacteriano dependiente de la concentración (cd) requiere de manera óptima lograr las siguientes variables PK/PD para considerar que se hace uso óptimo de este valioso antimicrobiano: C_max/CMI ≥ 10-12 (que la concentración máxima lograda dividida entre la concentración mínima inhibitoria resulte en los valores escritos) y/o que AUC_0-24/CMI ≥ 125 (que el valor del área bajo la curva de la concentración plasmática en 24 horas dividido entre la CMI resulte en el valor comentado) [4] Se ha descrito, sin embargo, que existen serias diferencias en la calidad de los preparados farmacéuticos [5] e incluso se han identificado preparados farmacéuticos conteniendo otros principios activos diferentes al declarado [6]. Por consecuencia esto ha generado que se identifiquen preparados farmacéuticos de enrofloxacina no-bioequivalentes, tanto en México [5, 7], como en Europa [8].

Para lograr las variables PK/PD dichas se requiere un manejo correcto del antimicrobiano, lo que incluye su uso en el agua de bebida, evitar que se diluya al no cerrar la llave de acceso del agua al tinaco, que se evite el contacto con la luz, que se use agua potable de baja dureza [9] y sin sustancias potabilizadoras añadidas [10], que no se le mezcle con otros ingredientes, que se purguen las tuberías, se limpien los niples y se provoque sed en la parvada para procurar que una o las dos variables mencionadas se logren (C_max/CMI ≥ 10-12 y AUC_0-24/CMI ≥ 125). Con el espíritu de lograr lo dicho se han sintetizado nuevos solvatos de enrofloxacina que superan al producto original en cuanto a las variables dichas [11] y se han incorporado promotores de la absorción [12]. A pesar de lo dicho, no es fácil lograr que se cumplan las condiciones detalladas y tampoco es dable provocar que el consumo de agua de las aves sea lo más abundante en la o las primeras tomas de agua, como para obtener un valor de C_max elevado [13, 14]

Dado lo anterior, se presenta como objetivo de este ensayo el uso de una nueva formulación farmacéutica de enrofloxacina incluida en perlas de alginato desecadas e incorporadas en el alimento, se describen sus rasgos farmacéuticos relevantes y se compara su farmacocinética con la de la enrofloxacina administrada en el agua de bebida en términos de las variables clave para un antibacteriano cd, esto es C_max/CMI ≥ 10-12 y AUC_0-24/CMI ≥ 125. Se tomaron como valores de CMI clave los denominados breakpoints (puntos de inflexión) aceptados en la literatura formal de tres bacterias clave: E. coli; Pasteurella multocida y Haemophlus gallinarum.

Materiales, Métodos y Resultados
El diseño del estudio y el manejo de animales cumplieron con las regulaciones mexicanas para el uso de animales experimentales según lo establecido por la Universidad Nacional de Autonomía de México (UNAM) y los estándares mexicanos establecidos en la NOM-062-ZOO-1999. La enrofloxacina-alginato en perlas secas (EAPS) se preparó mediante una solución de alginato de sodio (2.5% p/v) que contenga enrofloxacina (5% p/v - 7% p/v). La solución se dispersa con agitación constante, y se deja caer a través de una aguja de jeringa en una solución de CaCl₂ con agitación magnética constante para producir al instante de contacto las perlas. Se les recoge por filtración y se les seca al aire a temperatura ambiente no mayor a 20°C durante 48 h.

Caracterización de las EAPS
Eficiencia de atrapamiento (EE%) y caracterización de la carga del fármaco (% DL)
La eficiencia de atrapamiento (%) de enrofloxacina se determinó mediante el análisis de la enrofloxacina residual en la solución de CaCl2 mediante HPLC y por método espectrofotométrico UV-Vis con un espectrómetro S2000 utilizando una fuente de luz de deuterio DT1000, una interface de puerto serie SAD500 (Ocean Optics, Inc.), con cubeta de cuarzo de 10 mm de recorrido. Las mediciones se realizaron por triplicado a temperatura ambiente, y los datos se presentaron como media ± DE. La EE% se calculó de la siguiente manera:

La carga de fármaco (%) en perlas de alginato secas (EAPS) se determinó directamente. Las perlas de alginato se dispersaron en medios de liberación de buffer de fosfato pH 7.8 ± 0.1 (100 mL) con agitación magnética suave durante 24 h para liberar toda la enrofloxacina atrapada. La solución se centrifugó a 27,000 g durante 1 hora. La concentración de enrofloxacina se determinó en el sobrenadante por método espectrofotométrico UV-Vis con un S2000 espectrómetro con una fuente de luz de deuterio DT1000, un SAD500 interface de puerto serie (Ocean Optics, Inc.), con una longitud de onda de 10 mm y en una cubeta de cuarzo. Las mediciones se realizaron por triplicado a temperatura ambiente y los datos se presentan como media ± DE. El por ciento de carga de fármaco se expresa como la fracción de masa del fármaco atrapado en relación con la masa de las perlas de alginato y se calcula de la siguiente manera:

Variables PK/pd mejoradas de la enrofloxacina en pollo de engorda mediante el uso de perlas de alginato - Image 2

El contenido de enrofloxacina en EAPS para determinar la eficiencia de atrapamiento del fármaco (EE%) y la carga de fármaco en las EAPS (DL%) se cuantificó por referencia a una curva de calibración de enrofloxacina. Para la determinación del % de EE, se preparó una curva de calibración de enrofloxacina en agua por triplicado que fue lineal en el rango de concentración de 1-7 μg/mL (R² = 0.9999) en condiciones ambientales. Para DL%, la determinación de enrofloxacina se llevó a cabo por referencia a una curva de calibración preparada en tampón fosfato pH 7.8 ± 0.1 también por triplicado.

Esta relación fue lineal en el rango de concentración de 1 a 10 μg/mL (R² = 0.9999) en condiciones ambientales. Los EAPS se obtuvieron como partículas de color amarillento con un superficie lisa tipo perla irregular o con morfología de gota y un tamaño medio de 1,48 ± 10 mm y 1,60 ± 8 mm para enrofloxacina al 5% p/p y 7% p/p, respectivamente, como se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Microfotografía de perlas de alginato de enrofloxacina secadas al aire (EAPS) al 5% (arriba) y se muestra su tamaño

El % de EE determinado para EAPS es 95.52 ± 0.36% para enrofloxacina al 5% y 96.81 ± 0.06% para enrofloxacina al 7% y el % DL fue 56.45 ± 0.77% y 67.25 ± 2.80% para enrofloxacina al 5% y al 7%, respectivamente.

Espectroscopía infrarroja transformada-Fourier
Se caracterizaron las EAPS mediante espectroscopía infraroja transformada-Fourier para lo cual se registraron espectros infrarrojos de transmisión con un espectrofotómetro FTIR-FIR Spectrum 400 (PerkinElmer). Se midieron los espectros infrarrojos de las muestras en un rango de longitud de onda de 4000–400 cm⁻¹.

En la figura 3 se muestra el espectro de la enrofloxacina, en la que la que se superponen las bandas O-H y C-H, visibles en 3069, 2968, 2871, 2827 cm⁻¹ lo que indica la presencia de ácido carboxílico. A 1731 y 1625 cm⁻¹ se identifican dos picos afilados correspondientes a C = O. Las bandas en 1502 y 1462 cm⁻¹ corresponden a C = C del radical aromático. A 1336 cm− 1 se identifica al radical C–N de la amina terciaria. Finalmente, la banda a 1252 cm− 1 es el radical C–F (Kumar et al., 2014). También en la figura 2 (b) se ilustra el espectro de alginato puro, con una banda ancha a 3278 cm⁻¹ correspondiente a los grupos hidroxilo y una segunda banda a 1596 cm⁻¹ correspondiente a la vibración asimétrico de los grupos COO (Pereira et al., 2011). Los espectros FTIR de EAPS cargados con 5% o 7% de enrofloxacina se muestran en la Figura 2 (c y d), respectivamente.

Figura 3. Espectros FTIR de (a) enrofloxacina, (b) alginato, (c) 5% y (d) 7% de perlas secas que contienen enrofloxacina (EAPS)

Calorímetría diferencial de barrido (DSC)
El análisis DSC se llevó a cabo utilizando un sistema DSC1 Mettler Toledo. Se presentaron 5.0 mg de polvo de muestra en una bandeja de aluminio estándar y se calentó de 25 a 400 ° C con una velocidad constante de calentamiento de 10 ° C / min en una atmósfera de nitrógeno.

En la Figura 4 (a) se muestra un termograma típico de enrofloxacina pura. Se observa un pico endotérmico a 225 ° C, correspondiente al punto de fusión y un segundo pico endotérmico a 321 correspondiente al punto de inflamación [15].
La Figura 4 (b) muestra el termograma DSC de alginato puro, el pico endotérmico inicial a 88.86 ° C se ha correlacionado con la deshidratación de los grupos hidrofóbicos del polímero, el segundo y tercer picos exotérmicos, 247 ° C y 365 ° C, fueron de degradación del biopolímero por reacciones de polimerización (decarboxilación parcial de grupos y reacciones de oxidación de los polielectrolitos) [16]. Los termogramas correspondientes al 5% y 7% de ADBE se muestran en la Figura
4 (c) y la Figura 4 (d).

Figura 4. Termogramas calorimétricos de barrido diferencial de (a) enrofloxacina, (b) alginato, (c) perlas de enrofloxacina-alginato secas al 5% y (d) 7% (EAPS al 5 y al 7%).

Estudios de liberación de fármacos in vitro
Se realizaron mediante el método de la bolsa de diálisis. Se cargó una cantidad de EAPS en una bolsa de diálisis previamente hinchada. A continuación, el conjunto de diálisis se suspendió en medio de liberación a 37.0 ± 1°C (300 mL) en un vaso de precipitados cerrado con agitación magnética constante (500 rpm). La bolsa de diálisis se empapó primero en una solución tampón de ácido clorhídrico pH 3.0 ± 0.1 y se mantuvo durante 1.5 h para simular las condiciones gástricas.

Luego, se transfirió a una solución tampón de fosfato pH 7.8 ± 0.1 y se mantuvo durante 7,5 h para simular las condiciones intestinales. A los intervalos de tiempo determinados, se extrajo un volumen del medio de liberación y se analizó mediante el método espectrofotométrico UV-VIS. Para las condiciones gástricas, los intervalos de tiempo para la liberación del fármaco analizado fueron: 15, 30, 45, 60 y 90 min, y para las condiciones intestinales, los intervalos de tiempo para la liberación del fármaco analizado fueron: 15, 30, 45, 60, 90, 120 , 150, 180, 240, 300, 360 y 450 min (9 h). Para mantener las condiciones del modelo se añadió una cantidad igual de medio fresco después de cada extracción de muestra. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como media ± 1 DE. Se llevó a cabo un análisis espectrofotométrico UV-VIS de enrofloxacina a la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax = 273-280 nm). El análisis se realizó en un espectrómetro S2000 utilizando una fuente de luz de deuterio DT1000, una interfaz de puerto serie SAD500 (Ocean Optics, Inc.) y una cubeta de cuarzo de 10 mm de recorrido. Para la determinación de liberación de fármaco, se preparó una curva de calibración de enrofloxacina en solución tampón de ácido clorhídrico pH 3.0 ± 0.1 por triplicado, y fue lineal en el rango de concentración de 1-8 µg/mL (R2 = 0.9993). Se preparó otra curva de calibración en tampón fosfato pH 7.8 ± 0.1 por triplicado, y fue lineal en el rango de concentración de 1-10 µg/mL (R2 = 0.9999).

Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA), donde un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo (Statgraphics Centurion® XVII). El perfil de liberación de enrofloxacina se analizó para evaluar la cinética y el mecanismo de liberación de las perlas de alginato con una ecuación desarrollada por Korsmeyer-Peppas:

Donde, Mt/M∞ es la fracción de fármaco liberada en el tiempo t, k es la constante de velocidad de liberación y n es el exponente de liberación. que indica información sobre si el mecanismo de liberación es acorde a la ley de Fick (Fickian) (n= 0.5), o no (no-fickiana) (0.5> n < 1.0), o se ajustan a un mecanismo de transporte del caso II (n ≥ 1.0) (Lupo et al., 2015).

El perfil de liberación in vitro se muestra en la Figura 5. En condiciones gástricas se observó una liberación lenta (solo 9.32 ± 2.30%) para la formulación al 5% y 8.11 ± 0,18% para la formulación al 7% en 1,5 h. En la condición intestinal, se puede ver que la liberación acumulada aumentó hasta 76.60 ± 4.61% para la formulación al 5% y 58.08 ± 3.86% para la formulación al 7% (sin diferencia significativa, P ≥ 0,05). La enrofloxacina se liberó de forma continua y controlada durante
9 h. Los perfiles de liberación se ajustaron a la ecuación de Korsmeyer-Peppas. Ambas formulaciones, 5% p / py 7% p / p mostraron un valor de n atribuido a un mecanismo de transporte no-fickiano (0.5> n < 1.0) y al caso II (n ≥ 1.0) respectivamente, lo que indica que el transporte anómalo tiene una contribución predominante en la liberación de la enrofloxacina.

Figura 5. Perfil de liberación in vitro de enrofloxacina a partir de EAPS al 5% (●) y al 7% (○). Los símbolos corresponden a datos experimentales y la línea sólida corresponde a la liberación de fármaco del 60%, ajustada al modelo Korsmeyer–Peppas.

Estudios farmacocinéticos comparativas
Se realizaron 4 ensayos de farmacocinética, dos con enrofloxacina soluble (Baytril 10%, Elanco Salud Animal S.A. de C.V.) (Bay-10) y dos con las perlas de alginato desecadas conteniendo enrofloxacina (EAPS) en pollos Arbor Acress de aproximadamente 1 kg de peso, de la siguiente manera:

Grupo Bay-10_bolo que recibió. dosis oral bolo de enrofloxacina mediante depósito directo de 10 mg/kg de una solución en agua al 0.1% en el buche usando una sonda rígida.
Grupo EAPS_bolo que recibió mediante dosis oral bolo de enrofloxacina mediante depósito directo de 10 mg/kg de EAPS, depositándolas directamente en el buche mediante sonda rígida e incluidas en una suspensión de harina de arroz al 2%.
Grupo Bay-10_ad-libitum que recibió la dosis oral de enrofloxacina de aproximadamente 10 mg/kg por administración ad libitum en el agua de bebida con enrofloxacina de Bay-10 al 0.1% y un consumo calculado de agua al día (horas luz) de aproximadamente 180 mL.
Grupo EAPS_ad-libitum que recibió la dosis oral de enrofloxacina de aproximadamente 10 mg/kg por administración ad libitum en el alimento, calculando el número de EAPS/pollo de acuerdo con su consumo promedio de alimento/día (150 g)

Se trabajó en una granja de producción intensiva pero de tipo familiar con 3500 pollos Arbor-Acress de aproximadamente 1 kg de peso y cuyos consumos de alimento y de agua ya han sido señalados. Después de la dosificación con las modalidades de enrofloxacina dichas y para lograr una dosificación exacta se usaron los dos primeros grupos y para evaluar el comportamiento potencial en campo, se usaron los dos siguientes grupos. Asistidos por ayuda técnica se tomaron 5 muestras de sangre de la vena del ala por punción directa y por cada tiempo predeterminado: cero, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 horas en los dos primeros casos y a las cero, 2, 4, 8, 12 y 24 horas por tres días en los dos casos de administración ad libitum. Es importante señalar se obtuvieron entre 3 y 5 mL por pollo y que nunca se sangró una ave una segunda vez. La técnica para determinar lasconcentraciones de enrofloxacina en el plasma se basaron en cromatografía líquida de alta resolución de acuerdo con la metodología descrita originalmente por Idowu y Perkins ( [17] y validado en el Depto. de Fisiología y Farmacología de la FMVZ, UNAM.

En el cuadro 1 y se presentan los valores medios ± DE de los parámetros farmacocinéticos obtenidos para la enrofloxacina administrada como Bay-10 o como EAPS y las figuras 6 y 7 se muestran los perfiles plasmáticos de enrofloxacina obtenidos de los grupos ya referidos (Bay-10_bolo; EAPS_bolo; Bay-10_ad-libitum y EAPS_ad-libitum). Además, se presentan como referencia a su eficacia clínica las relaciones PK/PD, tomando el punto de corte de susceptibilidad para E coli en 0.1 y 0.5 µg/mL para bacterias sensibles y en su límite de susceptibilidad, respectivamente.

Discusión
El tubo gastrointestinal (TGI) en las aves tiene rasgos anatómicos y diferencias fisiológicas que lo diferencian notablemente del de los mamíferos y estos modifican significativamente los procesos farmacocinéticos de la mayoría de los fármacos.
Solo por mencionar un par de ejemplos, en las aves el tránsito TGI es muy rápido y la mayor parte de la absorción se realiza en un pequeño tramo del TGI, el asa duodenal. Por consecuencia el contacto de fármaco con el epitelio GI es limitado y con ello la biodisponibilidad de los fármacos [11] [18].A pesar de ello, se ha comentado que el establecimiento de las dosis en aves comerciales ha seguido un patrón de ensayo y error y que son pocos los estudios farmacocinéticos que apoyen un uso específico de antibacteriano en avicultura (Landoni y Albarellos, 2015). Más aún son pocos o nulos los diseños farmacéuticos destinados para la avicultura comercial [18, 19, 20] y esto a pesar de que el sector representa la principal fuente de proteína que consume el ser humano. Si a lo dicho se suma el exhorto que ha hecho la OMS para usar de manera óptima los antibacterianos, se puede empezar a contemplar el diseño y uso de presentaciones hechas ex profeso para la especie.

En ese sentido, los resultados obtenidos indican claramente que los valores más altos se lograron para la administración de EAPS en suspensión de arroz para la administración en bolo con C_max = 2.8 µg/mL ± 0.4 DE y AUC0-24 = 60 µg/h/mL ± 6.25 DE vs. C_max = 1.7 µg/mL ± 0.5 DE y AUC_0-24 = 49 µg/h/mL ± 6.5 DE, para la solución de Bay-10 administrada en bolo forzado. (P < 0,05 en ambos casos). Cuando las EAPS se administraron ad libitum en el alimento, se obtuvieron concentraciones plasmáticas superiores a las logradas por Bay-10ad-libitum, con valores máximos de 1.6 µg/mL vs. 0.8 µg/mL y una AUC_0-24 de….. µg/h/mL vs. ….. µg/h/mL, para EAPS_ad-libitum y Bay-10_ad-libitum, respectivamente.

Cuadro 1. Valores medios ± DE de los parámetros farmacocinéticos (PK) y las relaciones PK/PD para enrofloxacina en pollo de engorda medicado con enrofloxacina a dosis de 10 mg/kg como dosis bolo forzado por sonda de una solución de enrofloxacina (0.1%) (Baytril 10%, Elanco Salud Animal) y de enrofloxacina-alginato en perlas desecadas (EAPS) e incluidas en harina de arroz (2%) en agua; o ad libitum en el agua de bebida de una solución de enrofloxacina al 0.01% (Baytril 10%, Elanco Salud Animal) y de enrofloxacina-alginato en perlas desecadas (EAPS) incluidas como aderezo en la dieta.

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ɳ = 5 por punto en la curva;
C_max, concentración sérica máxima; Tmax, tiempo para alcanzar Cmax; T½ λ, vida media de eliminación;
AUC_0-24, área bajo la curva de concentración vs. tiempo en 24 h; AUC0 – ∞, área bajo la curva de concentración vs. tiempo de 0 a ∞; AUMC0 – ∞, área bajo la curva de concentración vs. tiempo/momento;
Fr, biodisponibilidad relativa en comparación con el grupo Bay-10 bolo (por ejemplo, AUC0-24EAPS/AUC0-24 Bay-10 × 100);
* PK / PD, relaciones farmacocinéticas/farmacodinámicas. El punto de corte bacteriano susceptible para las relaciones PK/PD de C_max/CMI y AUC_0-24/CMI fue de 0.1 y 0.5 µg/mL.
^{a, b, c} Letras diferentes dentro de cada fila indican una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (P ≤ 0.05).

Cuando se analizan las variables PK/PD detalladas en el cuadro 3, es claro que se espera una respuesta clínica muy superior de los EAPS, por comparación al Bay-10. No obstante, hay que señalar que ninguna de las dos formulaciones de enrofloxacina logró llegar a los valores de la variable C_max/CMI ≥ 8-10, cuando se asumió el valor denominado punto de inflexión (CMI = 0.5 µg/mL), lo que confirma dicho valor como generado por una cepa resistente de E. coli [21, 22]. No obstante, las relaciones de AUC_0-24/CMI0.5 resultaron en susceptibilidad para EAPS administrado tanto en el ensayo de dosis bolo como en el ensayo de administración ad libitum, lo que añade valor terapéutico a esta forma farmacéutica de enrofloxacina. Además es de destacarse que los EAPS se consumieron con aparente avidez por las aves y debido a la facilidad de administración y la farmacocinética favorable para EAPS incluidas como aderezo en el alimento de los pollos, este diseño puede ser considerado una opción terapéutica importante.

Figura 6. Perfiles plasmáticos de enrofloxacina logrados en pollo de engorda posterior a la administración en dosis bolo forzado por sonda de una solución de enrofloxacina (0.1%) (Baytril 10%, Elanco Salud Animal) y de enrofloxacina-alginato en perlas desecadas (EAPS) e incluidas en harina de arroz (2%) en agua.

En cuanto al uso correcto de la enrofloxacina y otras fluoroquinolonas se puede destacar con este ensayo que las variables PK/PD son mejores para los EAPS que para la enrofloxacina en solución. La enrofloxacina es un antibacteriano eficaz en el tratamiento y control de importantes patógenos avícolas como Mycoplasma, E. coli y Pasteurella spp, etc. Y se sabe que su eficacia idónea se logra cuando el régimen de dosificación maximiza las variables clave de C_max y AUC_0-24 [23, 24, 25]y con ello las proporciones PK/PD ya mencionadas.

Figura 7. Perfiles plasmáticos de enrofloxacina logrados en pollo de engorda posterior a la administración ad libitum en el agua de bebida de una solución de enrofloxacina al 0.01% (Baytril 10%, Elanco Salud Animal) y de enrofloxacina-alginato en perlas desecadas (EAPS) incluidas como aderezo en la dieta. Por consumo de agua o de alimento se calculó una dosis de enrofloxacina de10 mg/kg en ambos casos.

Figura 2. Microfotografía de perlas de alginato de enrofloxacina secadas al aire (EAPS) al 5% (arriba) y se muestra su tamaño

Figura 3. Espectros FTIR de (a) enrofloxacina, (b) alginato, (c) 5% y (d) 7% de perlas secas que contienen enrofloxacina (EAPS)

Figura 4. Termogramas calorimétricos de barrido diferencial de (a) enrofloxacina, (b) alginato, (c) perlas de enrofloxacina-alginato secas al 5% y (d) 7% (EAPS al 5 y al 7%).

Grupo Bay-10_bolo que recibió. dosis oral bolo de enrofloxacina mediante depósito directo de 10 mg/kg de una solución en agua al 0.1% en el buche usando una sonda rígida.
Grupo EAPS_bolo que recibió mediante dosis oral bolo de enrofloxacina mediante depósito directo de 10 mg/kg de EAPS, depositándolas directamente en el buche mediante sonda rígida e incluidas en una suspensión de harina de arroz al 2%.
Grupo Bay-10_ad-libitum que recibió la dosis oral de enrofloxacina de aproximadamente 10 mg/kg por administración ad libitum en el agua de bebida con enrofloxacina de Bay-10 al 0.1% y un consumo calculado de agua al día (horas luz) de aproximadamente 180 mL.
Grupo EAPS_ad-libitum que recibió la dosis oral de enrofloxacina de aproximadamente 10 mg/kg por administración ad libitum en el alimento, calculando el número de EAPS/pollo de acuerdo con su consumo promedio de alimento/día (150 g)

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