Detección e identificación de virus ADN que infectan pollos utilizando multiplex TaqMan en PCR tiempo real

La producción avícola viene siendo afectada por la presencia de enfermedades virales que causan pérdidas económicas. Por lo que el desarrollo de técnicas que permitan una rápida detección e identificación de estos virus ADN en pollos es importante para prevenir la dispersión de estos. Real-Time PCR permite detectar y cuantificar moléculas de ADN. El uso de sondas TaqMan en PCR en tiempo real incrementan la sensibilidad de la amplificación de ADN, permitiendo un mejor y exacto diagnostico que el PCR en tiempo real basado en Sybr Green. Un multiplex TaqMan PCR en tiempo real fue desarrollado y esto permitió un rápido análisis e identificación de múltiples virus ADN.

 

En este estudio 5 virus que afectan pollos fueron divididos en dos multiplex sets. Cada Multiplex set (MS) incluían primers y sondas específicos para la amplificación y detección de secuencias especificas de virus. MS-I detectó: MDV (MV094), EDS (ORF 1-hp) y FPV (4b); mientras MS-II: CAV (Vp 2), HVT (gp I) (Vacunas) y ILTV (gp B). Estas secuencias fueron determinadas por comparación genómica utilizando la base de datos de GenBank y los sets de multiplex fueron diseñados utilizando los programas PrimerBlast, NetPrimer y AlleleID. Los productos amplificados de PCR fueron secuenciados para verificar la correcta identidad de los productos de PCR. 

Para evaluar la sensibilidad y cuantificar los ADN blancos, los productos de PCR fueron clonados y luego diluidos en series de 10. La menor detección para la reacción de múltiplex fue: para MS-I: MDV (84.5 genomas), FPV (4.9 genomas) y EDS (43.95 genomas). Y para MS- II: CAV (630 genomas), ILTV (10 genomas) y HVT (8.75 genomas). Con el objetivo de validar cada set de multiplex, la sensibilidad (S) y especificidad (Sp) fueron calculadas utilizando muestras de ADN extraídas y analizadas durante los años 2008 – 2012 utilizando PCR en tiempo real con SybrGreen. 107 muestras fueron analizadas para MS-I. La S y Sp fueron 94.32% y 92.10% respectivamente. Para MS-II,
82 muestras fueron evaluadas. La S y Sp fueron 85.37% and 97.56% respectivamente.

Este estudio demuestra la aplicación de Multiplex TaqMan en PCR tiempo real como una herramienta útil - eficaz para la detección rápida y simultánea de diferentes tipos de virus de ADN en pollos infectados.