Control de Salmonella

Introducción

La producción avícola ha aumentado considerablemente en la última década. Con este aumento también han surgido preocupaciones en cuanto a la inocuidad alimentaria y, consecuentemente, se han publicado legislaciones cada vez más rígidas sobre la producción de estos alimentos desde la granja hasta la industria, para el control de patógenos con características zoonóticas, como Salmonella. Esta bacteria es responsable de infecciones alimentarias en humanos relacionadas con el consumo de carne de pollo y huevos contaminados (Rossi Júnior et al., 2009). De manera especial, normalmente la comunidad médica muestra mayor preocupación por las variedades serológicas (serovares) Enteritidis (SE) Y Typhimurium (ST). Sin embargo, actualmente, de acuerdo con los datos presentados por Back (comunicación personal) la serotipificación de los aislamientos procedentes de aves comerciales entre 2007 y 2010 muestra una reducción en estos serovares y un aumento en otros, como es el caso del serovar Minnesota (SM). Esto ha creado la necesidad urgente de realizar estudios para controlar otros serovares además de SE y ST.

Además, existen preocupaciones en la sociedad sobre el desarrollo de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos utilizados en la producción animal. Algunos países como Suecia (1986) y el resto de la Unión Europea (1997) iniciaron el proceso de eliminación de los antibióticos en la producción animal teniendo como base el "Principio de Precaución". En virtud de esto, ha aumentado el interés por buscar alternativas a los antibióticos para el control de los patógenos en diversas áreas de la producción pecuaria (Connoly, 2001).

Entre las alternativas probadas actualmente están los probióticos que, según Fuller (1989), son suplementos alimenticios compuestos por microorganismos vivos que afectan al animal hospedero, optimizando su balance microbiano intestinal. Puupponen-Pimiä et al. (2002) sugieren que la utilización de probióticos estimula la multiplicación de bacterias benéficas, ocasionando la reducción en la proliferación de bacterias potencialmente perjudiciales, y refuerza los mecanismos naturales de defensa. Los Lactobacillus son los principales microorganismos utilizados como probióticos, probablemente debido a que forman parte de la microbiota intestinal normal de las aves. Gabriel et al. (2006) descubrieron que los Lactobacillus, así como Streptococcus y algunas Coliformes se pueden encontrar en el intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon), en donde el pH tiende a ser más neutro. El ciego alberga una gran cantidad de bacterias Gram positivas y Gram negativas, como por ejemplo, Bifidobacterium, Bacteroides, Streptococcus y Clostridium.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la utilización probiótico a base de Lactobacillus, administrado en el agua, para el control de Salmonella enterica enterica serovar Minnesota.

Material y Métodos

Se utilizaron 54 pollos de engorde de 1 a 28 días de edad, divididos en tres grupos de 18 animales cada uno. El diseño experimental fue completamente al azar y cada animal fue una repetición, de acuerdo con lo descrito en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Muestras experimentales con sus respectivos tratamientos

Grupo	Descripción
Inoculación	Salmonella Minnesota (SM) 10⁸UFC/ml/ave
T1	Testigo sin inoculación y sin la adición de productos
T2	Testigo inoculado, sin la adición de productos
T3	Probiótico comercial vía agua de bebida los días 1, 19, 20 y 21 de vida de las aves con inoculación

El día de la llegada se sacrificaron seis animales y se les practicó la necropsia para recolectar asépticamente muestras de ciego, hígado y corazón, para investigar Salmonella spp. Todas estas aves resultaron negativas. Los animales se mantuvieron a la temperatura ideal de confort para las aves, proporcionándoles agua y alimento a voluntad. Se utilizó un alimento balanceado con niveles iguales o superiores a los recomendados por el Consejo Nacional de Investigación (National Research Council, NRC, 1994) de estados Unidos. A los 20 días de edad, todos los animales (excepto los del grupo 1) se inocularon oralmente con 1 ml de la solución de Salmonella Minnesota (SM) a una concentración de 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.

El producto probiótico comercial utilizado fue FloraMax B11^® (Vetanco) constituido por Lactobacillus bulgaricus, L. casei, L. cellobiosus, L. fermentum y L. helveticus, ofrecido en el agua de bebida los días 1, 19, 20 y 21 de vida de las aves, a razón de 30 g del producto diluido en 5 litros (l) de agua destilada.

Se tomaron muestras con hisopo de la cloaca de todas las aves, a las 48 horas postinoculación (PI) separándolos en conjuntos ("pools") de 4 aves, para luego contar las SM.

A los 28 días de vida, 7 días después de la inoculación con SM, 18 aves por tratamiento se sacrificaron y se les practicó la necropsia para recolectar asépticamente muestras de buche y ciego, y realizar el conteo de Salmonella (individual por cada animal) totalizando 18 análisis de ciego y 18 análisis de buche, por grupo.

Para el procedimiento del conteo de Salmonella, las muestras de hisopos de cloaca, ciego y buche se diluyeron en agua peptonada al 2%, en una proporción 1:9. Retiró 1 ml de cada solución de agua peptonada al 2%, pipetiándolo a otro tubo que contenía 9 ml de agua peptonada al 0.1%, y así sucesivamente, hasta las diluciones 10^-2 y 10^-3. Posteriormente se tomaron 100 μl de cada dilución para sembrar por triplicado placas de gelosa xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), utilizando un asa de Drigalsky para expandir el líquido en la placa. Las placas se incubaron en una estufa regulada a 35°C por 24 horas (h) y luego se sometieron al recuento de colonias típicas (adaptado de Desmidt et al., 1998).

La solución inicial de agua peptonada al 2% se incubó a 35°C por 24 h. En caso de no haber obtenido crecimiento de colonias típicas de Salmonella después de 24 h de incubación en ninguna muestra, se retiraron 100 μl de la solución inicial en agua peptonada al 2% y se agregó a un tubo que contenía 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis. Se incubó en una estufa regulada a 42°C por 24 h, para confirmación. Cuando una muestra resultó negativa a los conteos directos en el medio XLD, pero salió positiva después del proceso utilizando el medio selectivo, la muestra se consideró positiva en el orden de log 10 = 1 para el análisis estadístico. Los resultados de los conteos de colonias se expresaron de acuerdo con los Procedimientos de Conteo de Colonias de acuerdo con la Normativa Nº 6 publicada el 26 de agosto de 2003 (MAPA, BRASIL).

Los conteos de colonias de Salmonella se transformaron a Log10 para el análisis estadístico y se sometieron a la prueba T (P≤0.05).

Resultados y Discusión

Es importante subrayar que ningún ave presentó signos clínicos relacionados con la infección experimental con SM. Los resultados del presente estudio se muestran en el Cuadro 2. Los hisopos de cloaca muestreados a las 48 h PI, no mostraron diferencias significativas con respecto a la eliminación de SM, pero en los análisis microbiológicos realizados a los 7 días PI se puede observar una reducción significativa en la presencia de SM en el buche y en el ciego de las aves que recibieron el tratamiento con probióticos a base de Lactobacillus, en comparación con las del grupo testigo positivo, siendo dicha reducción del 56 y 51.1%, respectivamente.

Cuadro 2. Conteo de colonias de Salmonella en los diferentes grupos (medias±desviación estándar)

Tratamientos	*Conteo de Salmonella* en cada tipo de muestra (log UFC)**
Hisopos de cloaca 48 horas	Buche 7 días	Ciego 7 días
Testigo Negativo	0.00±0.00^B	0.00±0.00^C	0.00±0.00^C
Testigo Positivo	5.05±0.37^A	3.85±1.44^A	4.73±1.06^A
FloraMax B11^® en el agua + SM	5.26±0.54^A	1.69±1.19^B	2.31±1.72^B

^{A, B, C: letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas (P<0.05) según la prueba T.}

Estos resultados indican que el probiótico fue capaz de reducir la excreción de SM en el buche y en el ciego de los animales. Patterson y Burkholder (2003) citan que los microorganismos como Lactobacillus pueden inhibir a los patógenos mediante mecanismos como competencia por los sitios de unión, competencia por nutrimentos, producción de compuestos tóxico y estímulo del aparato inmunocompetente (sistema inmunológico). Estos mecanismos se pueden llamar de antagonismo bacteriano, interferencia bacteriana, efectos de barrera, resistencia a la colonización o exclusión competitiva. Otro factor que se debe tomar en cuenta en la acción de estas bacterias para reducir a los patógenos intestinales, es el efecto inmunorregulador de los probióticos en el sistema inmune de las aves, que puede mejorar la resistencia contra patógenos intestinales como por ejemplo Eimeria acervulina (EA). Dalloul et al. (2003) encontraron un aumento en los linfocitos intestinales intraepiteliales en las aves suplementadas con probióticos elaborados con Lactobacillus, en comparación con un grupo testigo sin la adición del producto. Dichos linfocitos ejercen un papel importante en la protección de la mucosa intestinal durante las infecciones y, en este caso, dieron como resultado una reducción en la excreción del número de ooquistes de EA.

Dado que en el presente estudio no evaluamos la respuesta inmune, no se puede concluir con seguridad si la reducción en la excreción de SM se debió al efecto directo de exclusión competitiva del probiótico o si se puede atribuir a un efecto asociado con la inmunomodulación provocada por Lactobacillus en las aves. Es necesario realizar más estudios para determinar mejor este mecanismo de acción.

Conclusiones

La utilización de este probióticos a base de Lactobacillus puede reducir la excreción de Salmonella Minnesota y puede ser de ayuda en el control de esta infección.

Bibliografía

Brasil, Instrução Normativa nº 6 de 26 de Agosto de 2003. 2003. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Diário Oficial da União.

Connoly A. 2001. Reagindo ao desafio da retirada dos antibióticos promotores de crescimento das rações e a forma como os oligossacarídeos específicos assumiram a dianteira.Feed compounder junho/julho:20-25.

Dalloul RA, Lillehoj HS, Shellem TA, Doerr JA. 2003. Enhanced mucosal immunity against Eimeria acervulina in broilers fed a Lactobacillus-Based probiotic. Poult Sci 82:62-66.

Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck F. 1998. Serological and Bacteriological observations on experimental infection with Salmonella Hadar in chickens. Vet Microbiol 60:259-269.

Fuller R,1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66:365-378.

Gabriel I, Lessire M, Mallet S, Guillot JF. 2006. Microflora of the digestive tract: critical factors and consequences for poultry. World's Poult Sci J 62:499-511.

National Research Council. 1994. Nutrient requirements of poultry. 9th rev.ed. National Academy Press: Washington, D.C.

Patterson JA & Burkholder KM. 2003. Application of Prebiotics and Probiotics in Poultry Production. Poult Sci 82:627-631.

Puupponen-Pimiä R, Aura AM, Oksmancaldentey KM, Myllärinen P, Saarela M, Mattila-Sanholm T, Poutanen K. 2002. Development of functional ingredients for gut health.Trends Food Sci Technol 13:3-11.

Rossi Junior OD, Berchieri Júnior A, Felipe LM. 2009. Agentes de interesse em saúde pública associados a produtos de origem avícola. pp.1039-1053. In: Doenças das Aves. Berchieri Júnior A, Silva EN, Di Fábio J, Sesti L, Zuanaze MAF (eds.). Fundação APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas. Campinas, SP, Brasil.

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