Utilización de streptomyces sp. Rl8 como agente probiótico en pollos de la raza Leghorn

La producción avícola a nivel internacional ha ido incrementándose a medida que avanzan los nuevos métodos de crianza de gallinas ponedoras y pollos de ceba. En las instalaciones avícolas los pollitos eclosionan en un medio casi estéril y son ubicados en sus primeras semanas de vida en galpones con condiciones higiénicas estables, que imposibilitan la colonización de una microbiota intestinal beneficiosa; además de esto, los pollos están sometidos a situaciones que les producen estrés como son: una alta densidad poblacional, vacunación, altas o bajas temperaturas, humedad inadecuada, incidencia de gases tóxicos e inmunodepresión; que ocasionan desbalances de la microbiota intestinal en caso de que esta exista (Rondón et al., 2008). De esta manera, las aves se encuentran expuestas a la incidencia de microorganismos patógenos que pueden causar enfermedades gastrointestinales como la salmonelosis y la colibacilosis (La Ragione et al., 2001; Barnes et al., 2003). Para contrarrestar los efectos de dichas enfermedades se utilizan antibióticos de amplio espectro; pero estos compuestos han originado graves problemas de resistencia microbiana y efectos residuales que ponen en riesgo la inocuidad alimentaria. Por otro lado, éstos aumentan los costos de producción y una notable disminución en los índices productivos de la industria avícola.

En Cuba, no se emplean estos productos, pero existe la experiencia biotecnológica necesaria para desarrollarlos con tecnologías económicamente viables, y que a su vez, mejoren el rendimiento bioproductivo y la salud de los animales (Collins & Gibson, 1999; Pérez et al., 2011). En nuestro país no se han realizado estudios donde se utilice como aditivo probiótico los estreptomicetos como agentes controladores de la colibacilosis y otras enfermedades zoonóticas de origen bacteriano, cuando se conoce que los actinomicetos representan una fuente de metabolitos bioactivos para combatir la resistencia bacteriana de antibióticos usados comúnmente (Lino-Navarro et al., 2016).

Por lo anteriormente expuesto se plantea la utilización de probióticos como coadyuvantes dietéticos de origen microbiano que benefician la fisiología del hospedante al modular la inmunidad de la mucosa y la inmunidad sistémica, así como mejorar el balance nutricional y microbiano en el tracto gastrointestinal durante la producción avícola (Tannock, 1999). Se reporta además que en la mayoría de los casos dichos aditivos microbianos suelen ser muy satisfactorios por los buenos rendimientos productivos. Entre los probióticos de uso avícola se destacan aquellos que contienen microorganismos autóctonos del tracto gastrointestinal de aves en estado saludable (Miroslava et al., 2004), constitui dos principalmente por diferentes especies de los géneros bacterianos Lactobacillus Beijerink, 1901, Bacillus, Cohn, 1872, Streptococcus Rosenbach, 1884 y Enterococcus (ex Thiercelin & Jpuhaud, 1903) Schleifer & Kilpper-Bäiz, 1984 y levaduras del género Saccharomyces; los cuales han demostrado una alta eficiencia en la reducción de patógenos intestinales y en el aumento de los indicadores bioproductivos (Lara-Mantilla & Burgos-Portacio, 2012).

Los actinomicetos constituyen uno de los miembros más importantes en el mundo microbiano por su potencial para producir compuestos biológicamente activos. Se plantea que alrededor del 45 % de todos los compuestos bioactivos obtenidos a partir de microorganismos, son producidos por actinomicetos (Berdy, 2005). Los antibióticos utilizados en la práctica clínica tales como la fosfomicina, lincomicina, neomicina, estreptomicina, daptomicina, la eritromicina y la tetraciclina son producidos por el género S tre p t omy c e s p e rt e n e c i e n t e a l Or d e n Actinomycetales(Mahajan & Balachandran, 2011; Ullah et al., 2012). Streptomyces Waksman & Henrici, 1943 es un género de bacterias Gram positivas, que crece en diferentes entornos y su forma se asemeja a los hongos filamentosos. La diferencia morfológica de Streptomyces implica la formación de una capa de hifas que pueden diferenciarse en una cadena de esporas. Los miembros de este género son habitualmente reconocidos como microorganismos GRAS (según sus siglas en inglés) (Lanoot, 2005). La propiedad más interesante de Streptomyces es la capacidad de producir metabolitos secundarios bioactivos, tales como antifúngicos, antivirales, antitumorales, antihipertensivos, inmunosupresores y especialmente antibióticos. La producción de la mayoría de los antibióticos es específica de la especie, y estos metabolitos secundarios son importantes para las especies del género Streptomyces, ya que les confieren una capacidad especial para competir con otros microorganismos con los que entran en contacto, incluso con especies del mismo género (Prócopio et al., 2012; García, 2016).

En Cuba no se emplean estos productos, pero existe la experiencia biotecnológica necesaria para desarrollarlos con tecnologías económicamente viables, que mejoren a su vez el rendimiento productivo y la salud de los animales (Collins & Gibson, 1999; Pérez et al., 2011). Actualmente se utilizan antibióticos para la disminución de la carga bacteriana en muchas granjas productoras de huevos; lo cual está trayendo consigo resistencia a los mismos que, junto a otros factores, posibilitan una amplia proliferación de bacterias patógenas con un alto grado de mortalidad en pollos de la raza Leghorn de 21 días de edad, debido a la alta colonización intestinal y resistencia causada por Escherichia coli(Escherich, 1885).

El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad probiótica de Streptomyces RL8 en indicadores fisiológicos y productivos en pollos de la raza Leghorn.

Evaluación de los efectos de Streptomyces RL8 sobre parámetros productivos y de salud

Animales y dieta basal
Para la experimentación se emplearon 60 animales, 30 hembras y 30 machos, de la raza Leghorn de un día de edad, con peso vivo promedio de 38,72 g, que se distribuyeron a razón de 30 aves por tratamiento (Figura 1). Los animales recibieron ad libitum el agua y el alimento a base de maíz y soya enriquecido con el suplemento probiótico a una carga de 10⁸ ufc·g^-1.

Microorganismo de ensayo
Se utilizó la cepa de Streptomyces RL8, la cual se creció en Caldo Triptona Soya e incubó a 28 ºC con agitación; seguido de inoculación en un subproducto de la producción agrícola como sustrato sólido e incubación a 28 ºC. El mismo se conservó a 25 ºC hasta su utilización.

Tratamientos experimentales
Se establecieron dos grupos de animales los cuales fueron alimentados hasta los 21 días de edad. El cultivo microbiano en sustrato sólido se mezcló, diariamente, de forma manual con la dieta basal. Los grupos experimentales fueron:

Grupo control (I): con adición de sustrato sólido.
Grupo RL8 (II): con adición de sustrato sólido conteniendo Streptomyces RL8 a 10⁸ ufc·g^-1 de pienso.

Condiciones experimentales y sistema de manejo de los animales:
Los animales se alojaron en jaulas metálicas a una densidad de 25 aves m² hasta los 18 días de edad, posteriormente se redistribuyen según el 2 tratamiento a 12-13 aves m² según (García, 2011). El sistema de vacunación de los animales consistió en una dosis de Marek y Gumboro el primer día de edad.

Procedimiento experimental para la toma y análisis de las muestras:
Los muestreos se ejecutaron a los 21 días de edad de los animales, los cuales se pesaron y sacrificaron por desangramiento de la vena yugular descrito por Lissette (2015). Se tomó una muestra de 1 mL de sangre por cada animal en tubos conteniendo heparina sódica. Se determinó el efecto de la cepa de Streptomyces RL8 sobre los parámetros de crecimiento en función de los siguientes indicadores: Peso vivo, Ganancia de peso vivo (GMD), Incremento de Peso (IP), Peso relativo de: Pechuga y Piernas. Para analizar los parámetros morfométricos se pesaron, Intestino Delgado (ID), Intestino Grueso (IG), los Ciegos vacíos, Hígado y Pechuga. Se determinó el peso del bazo como órgano inmune en una balanza técnica Sartorius BL 1 500 según - (Asghar et al., 2015). El peso relativo de estos órganos se expresó en g·kg ^-1 de peso vivo del animal descrito por (Herrera et al., 2007; García, 2011).

Caracterización de los efectos hematológicos de Streptomyces RL8 en aves
A las muestras de sangre de cada animal se le determinó la hemoglobina (Hb) (g·dl ^{- 1}), hematocrito (Ht) (%) y Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM) (g·dl ^-1), linfocitos (%), glóbulos blancos (GB), heterófilos (%) y eosinófilos (%) (Asghar et al., 2015). Para la determinación de hemoglobina se utilizó el método de la cianometahemoglobina (Crosby et al., 1954), tomando 0,2 mL de sangre diluida con 5 mL del reactivo de Drabkin seguido de lectura a 540 nm después de 10 min, usando agua destilada como blanco.

Para la determinación de hematocrito se llenaron de sangre los capilares para microhematocrito hasta una tercera parte del capilar. Estos se sellaron con mechero y se centrifugaron durante diez minutos en microcentrífuga. Posteriormente, se realizó la lectura en equipo de microhematocrito marca Hawkley con lector de escala móvil que permitió situarlo en el nivel de los sedimentos hemáticos y proceder entonces a la lectura (García, 2011).

Tratamiento estadístico
Se utilizó el software STATISTICA 8.0.360 para Windows. Para los datos paramétricos se realizó un ANOVA. Para datos que no presentan una distribución normal se realizó la prueba a posteriori de Duncan para p< 0,05.
 

Efecto de Streptomyces RL8 sobre los parámetros productivos y de salud

Productivos y de Salud
La tabla 1 muestra el comportamiento de los indicadores productivos de los animales durante la evaluación del microorganismo candidato a probiótico. Estadísticamente no hubo diferencias significativas entre el grupo tratado con la cepa de Streptomyces RL8 y el control. Los valores obtenidos en este experimento fueron muy inferiores a los que obtuvo (García, 2016; Rahimi & Khaksefidi, 2006b) al tratar pollos de ceba tratados con Lactobacillus spp. Todo parece indicar que el probiótico utilizado no ejerce efecto sobre el peso de los pollos evaluados. 

Los parámetros productivos y de salud mostrados en la tabla 2, peso de Pechuga (g) y Muslos + Piernas (g), no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado con Streptomyces RL8 y el grupo control. Esto no quiere decir que no se detectaran algunas diferencias entre los grupos. Los mayores pesos de la Pechuga se encontraron en el grupo tratado con la cepa RL8, mientras que los mayores valores encontrados en cuanto al peso de los Muslos más Piernas fueron mostrados por el grupo control. Es posible que los microorganismos candidatos a probióticos evaluados actúen en el metabolismo del animal, tanto energético como proteico, al obtenerse un estado eubiósico en el intestino, acción que da lugar al aumento del tiempo de recambio de las células intestinales, lo que provoca ahorro sustancial en los nutrientes digeridos por el animal y posibilita que estos puedan utilizarse en la producción de masa muscular, entre otras funciones (García, 2011). Es importante destacar que se evaluaron gallinas ponedoras de la raza Leghorn, las cuales no se caracterizan por una elevada producción de carne, su importancia económica radica en la puesta de huevos, lo cual no fue objeto de estudio de esta investigación.

Morfométricos
La tabla 3 muestra los resultados de los indicadores morfométricos de las aves a los 21 días de edad. No se encontraron diferencias significativas para el peso relativo del hígado, intestino delgado, intestino grueso y ciego; quizás debido a que los aditivos microbianos evaluados no ejercieron acción en estos órganos, efecto similar al observado por Milián (2009), Rondón (2009), Gunal et al. (2006) y García (2011), al evaluar pollos de engorde con cepas de Lactobacillus pentosus (ex Fred 1921) Zanoni et al. 1987 LB 31, Wickerhamomyces anomalus (E.C. Hansen) Kurtzman, Robnett & Basehoar-Powers 2008 LV6, Bacillus subtilis (Ehrenberg, 1835) Cohn, 1872 y Lactobacillus salivarius Rogosa et al. 1953, respectivamente (García, 2011). 

Los valores de intestino delgado variaron de acuerdo al grupo control y al tratado con la cepa RL8. La inclusión del microorganismo candidato a probiótico en la dieta de los pollos aumentó el peso relativo del intestino delgado a los 21 días. Este comportamiento pudiera estar relacionado con lo informado por Awad et al. (2010), quien sugiere que cuando se incluyen probióticos en la dieta de los animales se mejora la estructura intestinal y aumenta la eficiencia de los procesos digestivos y abortivos (García, 2011).

En el caso de los valores de intestino grueso e hígado fueron superiores a los obtenidos por García (2011), en pollos de engorde a los 21 días de edad, bajo tratamiento con Lactobacillus spp. Los ciegos de los animales tratados mostraron valores superiores a los obtenidos por García (2011).

Efecto de Streptomyces RL8 sobre los parámetros hematológicos de aves
La tabla 4 muestra los resultados del análisis hematológico. Aunque los valores de hemoglobina (Hb) y hematocrito (Hto) se mantuvieron dentro de los rangos normales de crianza (23-55 % y 7,0-18,6 g·dL^-1 , respectivamente (Anon, 2013)) en ambos g r u p o s, e st e ú l t i m o p a r á m e t r o f u e significativamente superior en el grupo tratado con Streptomyces RL8. Sin embargo, estos valores de hemoglobina y hematocrito fueron inferiores a los que obtuvo (Fernández et al., 2014) en pollos de ceba, pero coinciden con los obtenidos por García (2011) al evaluar L. pentosus LB-31, W. anomalus LV-6 y su mezcla en pollos de engorde; y con Gutiérrez & Corredor-Matus (2017) quienes eva lua ron pollos de c eba tr a t ados con Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen 1883, Lactobacillus acidophilus (Moro 1900) Hansen & Mocquot 1970, B. subtilis y una mezcla de los tres.

Haile & Chanie (2014) plantean que los pollos suelen tener valores de hematocrito relativamente bajos (tan bajo como 24%), los cuales aumentan con la edad. Los resultados difieren de los encontrados por Cardoso et al. (2014) con valores medios de hematocrito del 36% en pollos de engorde alimentados con probióticos a base de Lactobacillus, Streptococcus y Bifidobacterium. Igualmente Fernández et al. (2014) encontraron valores de hematocrito de 36% en pollos de engorde suplementados con B. subtilis. Es probable que el tipo de dieta, proporciones de los nutrientes utilizados, y la raza, pudieran influir en los resultados discrepantes (Gutiérrez & CorredorMatus, 2017).

Los valores de eosinófilos aumentaron significativamente en el grupo tratado con Streptomyces RL8 en relación al grupo control (Tabla 3). Al parecer el sistema inmune se vio estimulado por este microorganismo, efecto que se ve reflejado con el aumento del bazo como órgano modulador (Tabla 2). Superiores a los encontrados por Asghar et al. (2015) y Gutiérrez & Corredor - Matus (2017), donde utilizaron S. cerevisiae, L. acidophilus, B. subtilis y una mezcla entre ellos.

No se detectaron diferencias significativas entre el grupo control y el tratado con la cepa RL8 en cuanto al conteo linfocitario; cuyo valor estuvo dentro del rango del 68-77 % (Asghar et al., 2015; Avilez-Colon et al., 2015), quienes usaron el probiótico comercial Gallipro®. Por el contrario, Hassan Khan et al., (2011) obtuvieron valores inferiores a los alcanzados en este trabajo durante una investigación con pollos ponedores de la raza Hy-Line W-98, utilizando dietas enriquecidas con enzimas, probióticos y combinaciones entre ambos.

El conteo de glóbulos blancos no difirió entre el grupo tratado y el control, y se mantuvo dentro de los valores normales para aves. Sin embargo, fueron inferiores a los que obtuvo Rahimi & Khaksefidi (2006a) al tratar pollos de engorde con el antibiótico virgianiamycim y el probiótico comercial BioPlus 2B®, y similares a los que obtuvo Asghar et al. (2015) al tratar pollos de ceba con Gallipro®.

La concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) no varió en ninguno de los dos grupos. El uso de probióticos en forma combinada ha reportado mejores resultados que al utilizarlos individualmente, lo cual podría explicar la indiferencia entre los grupos (Veizaj-Delia et al., 2010). Sin embargo, estos valores difieren de lo encontrado por Cardoso et al. (2014) quienes reportan un valor medio de CHCM en aves alimentadas con probióticos, antibióticos y un grupo control de 22,56; 23,42 y 23,115 g·dl ^-1 , respectivamente. Por el contrario coinciden con Avilez-Colon et al. (2015) con valores de CHCM de 33,17 g·dl  ^-1. Es posible según Gutiérrez & Corredor-Matus (2017) que a primera vista, la diferencia sea grande al confrontarla con nuestros resultados; sin embargo, el tipo de probiótico así como las condiciones geográficas, climáticas, nutricionales y sanitarias en que se desarrolló el experimento pudieron influir en el resultado.

Los heterófilos son leucocitos polimorfonucleares de aves de corral que son homólogos a los neutrónicos en los mamíferos. Tienen acción fagocítica primaria en la respuesta inflamatoria contra agentes infecciosos, como bacterias y hongos (Marietto-Gonçalves et al., 2014). La relación de heterófilos a linfocitos se ha aceptado como un índice confiable para determinar el estrés en aves de corral. Los heterófilos son parte de la inmunidad natural y defensa celular contra las infecciones microbianas, y los linfocitos son células que producen anticuerpos. Los aumentos en la relación de heterófilos a linfocitos en pollos desafiados se pueden atribuir a una mayor secreción de corticosterona (Vleck et al., 2000), lo que finalmente da como resultado una disminución del título de anticuerpos. En la reciente investigación se muestra una notable diferencia en cuanto al conteo de heterófilos entre el grupo tratado con la cepa RL8 y el control no tratado. Las aves fueron analizadas minuciosamente postmorten, buscando evidencias de agentes patógenos dentro del grupo tratado y no se mostraron síntomas infecciosos, lo cual indica que el agente probiótico ejerció una fuerte influencia sobre el sistema inmune de las aves. Estos resultados concuerdan con los hallazgos de Asghar et al. (2015),Vleck et al. (2000) y de Rahimi & Khaksefidi (2006), quienes demostraron que la suplementación de la dieta con probióticos aumentó significativamente el recuento deglóbulos blancos en comparación con el grupo de control.

Todo parece indicar que la cepa utilizada en esta investigación está ejerciendo una fuerte influencia sobre el sistema inmune, lo cual pudiera contribuir al fortalecimiento del mismo. 

Se concluye que la cepa de Streptomyces sp. RL8 pudiese ser utilizada como agente probiótico en pollos raza Leghorn de 0-21 días de edad, principalmente como estimulante hematológico y por su función moduladora sobre el sistema inmune celular.