Desarrollo y evaluacion de diagnostico de salmonella gallinarum por pcr tiempo real

El término salmonelosis es empleado para describir la infección causada por microorganismos del genero Salmonella. En la actualidad se conocen más de 2,500 serotipos de este género, solo algunos de ellos son capaces de producir enfermedades en animales domésticos y el hombre (1,2). La salmonelosis aviar es causada por cuatro diferentes serotipos de Salmonella en los cuales se encuentran dos que son específicos de aves (Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum) y dos serotipos que carecen de especificidad de huésped (Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium).

El aislamiento de los microorganismos del género Salmonella se realiza a partir del tracto intestinal así como de ganglios linfáticos, hígado, bazo, vesícula biliar en mamíferos infectados y en aves se incluyen los ovarios, testículos y tonsilas cecales. Los animales que se encuentran infectados la excretan en cantidades considerables en las heces; contaminando el medio ambiente y propiciando la diseminación rápida de la infección por vía fecal-oral lo que podría producir un brote (2).

A pesar de que México se declaro libre de Salmonella gallinarum desde el 8 de septiembre de 2009 aun existe incidencia de este microorganismo en otras partes del mundo, por lo que ha surgido la necesidad de desarrollar distintas técnicas de diagnóstico que puedan ofrecer un resultado oportuno; que permitan determinar que el país sigue libre de esta enfermedad; dentro de las principales pruebas de diagnóstico se encuentra el aislamiento bacteriológico que permite identificar el agente causal, para lo cual se requiere que la muestra sea sembrada en un medio de enriquecimiento selectivo, ya sea caldo selenito ó tetrationato, después de una incubación las muestras sospechosas deben ser sembradas en un medio selectivo, como el agar Mc Conkey ó agar verde brillante, en los cuales si crecen colonias sospechosas, regularmente lactosa negativas, se les realiza pruebas  bioquímicas con el fin de identificar el género y especie. El aislamiento ha sido una técnica muy eficaz para el diagnóstico de la salmonelosis, sin embargo el tiempo en el que se emite un resultado es tardado (entre 3 y 4 días) (3, 4, 5). Una prueba complementaria al aislamiento bacteriológico, es la aglutinación rápida en placa con sangre completa, para la realización de la prueba se utiliza antígeno K Polivalente, dicho antígeno es utilizado para la  detección serológica de aves portadoras de Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum, sin embargo esta prueba tiene la desventaja de ser poco especifica y solo es capaz de diferenciar los serotipos gallinarum y pullorum de todos los demás existentes para el género Salmonella, adicionalmente, si el resultado es positivo requiere ser comprobado por medio de aislamiento bacteriológico (3). Otra prueba diagnóstica son los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), este tipo de técnicas se basa en la detección de anticuerpos IgM e IgG. La ventaja de esta prueba serológica es que se detecta la presencia de los anticuerpos IgG circulantes, aunque el principal inconveniente es que las concentraciones séricas de IgG pueden ser bajas al principio de la infección y por ende indetectables; a pesar de que esta técnica es rápida, los resultados de la ELISA no son del todo confiables debido a que ocurren reacciones cruzadas entre antígenos y anticuerpos, esto puede generar falsos positivos ó falsos negativos. Algunos países utilizan el antígeno pullorum, el problema en la utilización de dicho antígeno es que detecta a otras especies invasivas de Salmonella, tales como Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium, lo que pueden ocasionar resultados falsos-positivos en la prueba (6).

Hoy en día las técnicas de Biología Molecular constituyen un gran instrumento de diagnóstico, estas han cambiado totalmente el modo detección de las enfermedades, pues permiten emplear el material genético del microorganismo. Una de estas técnicas es la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR por sus siglas en ingles), este es un método in vitro que permite la amplificación de una región específica dentro de una molécula de ADN, generando millones de copias de este fragmento partiendo de una pequeña cantidad de acido desoxirribonucleico (ADN), lo que permite que la prueba sea más sensible y especifica respecto a las pruebas de diagnóstico anteriormente mencionadas.

 

Para el diseño de la sonda se tomó como referencia el gen rfbs, específico del género Salmonella grupo D, que dentro de su secuencia tiene dos polimorfismos, el primero puede diferenciar el serotipo Salmonella gallinarum de Salmonella pullorum; sin embargo este polimorfismo es el mismo para las serovariedades gallinarum, dublin y enteritidis, mientras que el segundo polimorfismo es capaz de diferenciar el serotipo Salmonella gallinarum de Salmonella pullorum de todos los serotipos de Salmonella del grupo D. Para el diseño de primers y sondas, fue realizado el alineamiento con el programa Clone Manager Suit; los serotipos utilizados fueron: Salmonella gallinarum cepa ATCC 9184 (No. acceso: AF442573.1), Salmonella gallinarum cepa Chonbuk (No. acceso: AF442574.2), Salmonella pullorum cepa ATCC 10398 (No. acceso: DQ074437.1), Salmonella pullorum cepa ATCC 13036 (No. acceso: DQ074436.1), Salmonella pullorum cepa S11 (No. acceso: AF442575.1), Salmonella dublin (No. acceso: AY596796.1) y Salmonella enteritidis (No. acceso: AY596797.1); el alineamiento de las secuencias del gen rfbs fue tomado como referencia para ubicar las posiciones de los oligonucleótidos y la sonda; las condiciones para este diseño se basaron en los requerimientos del IDT Technologies (www.idt.mx), también fue empleada la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para realizar una búsqueda en la base de datos de nucleótidos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), para encontrar la similitud entre la secuencia de la sonda con otras secuencias; con estas herramientas se determinaron las siguientes condiciones: formación de dímeros, estructuras secundarias, que el tamaño de la sonda fuera el apropiado, el contenido de GC no rebasara los límites permisibles, y la temperatura de fusión (Tm) que no estuviera demasiado alejada de la Tm de los iniciadores; la sonda fue marcada con el fluoróforo FAM (6-carboxifluoresceína) y el
apagador es NFQ (Non Fluorescent Quencher). 

La PCR-TR se llevo a cabo utilizando el kit  Path ID qPCR Master Mix AMBION ® de acuerdo con las instrucciones del fabricante, las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ®. 

Una vez diseñados los iniciadores y sonda, se realizaron pruebas para determinar la especificidad de los mismos con varias cepas del serogrupo D con las cuales comparte el gen rfbs. Asimismo fueron realizadas pruebas para conocer el límite de detección inferior del patógeno así como la sensibilidad. 

Los iniciadores y sondas diseñados para el diagnostico de Salmonella gallinarum, al ser probados con cepas que podrían encontrarse en el tracto digestivo de los pollos no presentaron amplificación incluyendo cepas comprendidas en serogrupo D. 

Con las diluciones realizadas se determinó que la PCR-TR tienen la capacidad de detectar una concentración de 1 pg de ADN genómico, sin embargo, a pesar de que equipo es capaz de detectar hasta 0.1 pg de ADN genómico este resultado se considera como sospechoso (Figura 1); la sensibilidad obtenida con esta técnica demuestra que es más sensible que la PCR punto final descrita por Shah et al. 2005., que sólo es capaz de detectar hasta 100 pg de ADN genómico. 

Para poder calcular la cantidad de bacterias de este ensayo, se realizó la medición por espectrofotometría de un cultivo bacteriano de la cepa Salmonella gallinarum hasta alcanzar una absorbancia de 0.10 considerando que la literatura reporta que  una suspensión de bacterias a una longitud de onda de 625 nm si tiene una absorbanciade 0.08 a 0.10, contiene aproximadamente 1 x 108 unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) (7). Posteriormente fueron realizadas diluciones decuples seriadas por triplicado a partir del inoculo que contenía 1 x 108 UFC/ml hasta llegar a la dilución 1 x 100 UFC/ml, esto corresponde a 10 UFC/ml, después se realizó la extracción de ADN utilizando el kit MagMAX™-96 DNA Multi- Sample AMBION ® para mas tarde realizar la PCR; esta prueba se realizó con el fin de comprobar que tan sensible es la PCR-TR y demostrar cuantas bacterias es capaz de detectar.

1 -Regan E, Mc Cabe E. (2008). Development of a real-time multiplex PCR Assay for the detection of multiple Salmonella serotypes in chicken samples. Department of Microbiology, National University of Ireland Galway.

3.- Norma Oficial Mexicana NOM-005-ZOO- 1993, “CAMPAÑA NACIONAL CONTRA LA SALMONELOSIS AVIAR” 

4- http://wwwsenasica.gob.mx/Campaña Nacional contra la Salmonelosis Aviar. 

5.- Caffer, M. Terragno, R. y Binsztein, N. (2008) Manual de Procedimientos Diagnóstico y caracterización de Salmonella spp. Departamento Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”. Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur. 

6.- Avícola Metrenco E.I.R.L. (2007). Principales enfermedades de las aves “Revisión sobre pulorosis y tifosis aviar; nuevos enfoques para viejos conceptos 

7.- Sambrook, J. y Russel, D. (2001). Protocolo  26, Transformation of E.coli by Electroporacion. Molecular Cloning a Laboratory manual, 3rd edition. New york