Tifosis aviar

La Argentina exporta cada vez más productos agropecuarios de origen animal y los países importadores restringen paulatinamente el empleo de antibióticos en producción animal.

Dado que el INTA de Balcarce cuenta con los conocimientos y la tecnología para evaluar la acción de desinfectantes empleando modelos experimentales animales, y que PSC Argentina S.R.L. posee la representación del desinfectante TIMSEN®, se realizó un Convenio de Asistencia Técnica Institucional para evaluar la acción del mismo en aves infectadas con diversas enfermedades bacterianas, entre ellas la Tifosis Aviar.

El presente artículo contiene una síntesis del estudio realizado respecto de Tifosis Aviar, dirigido a lectores interesados en el tema desde el punto de vista de la producción aviar.


Resumen

Para determinar la dosis oral más adecuada del desinfectante TIMSENTM (N-alquil dimetil benzilo cloruro de amonio) que sea capaz de prevenir la transmisión horizontal de pollitos en estrecho contacto con Salmonella gallinarum, se realizó un ensayo empleando 390 pollitos de 21 días de edad. Las aves fueron divididas en 6 grupos de 65 pollitos cada uno. Los pollitos fueron tratados con diferentes dosis del desinfectante en el agua de bebida: 0, 25, 50, 100, 250 y 500 ppm (Grupos A, B, C, D, E y F respectivamente). Veinticuatro horas después de administrado el desinfectante, 30 pollitos de cada grupo fueron inoculados dentro del buche con 109 bacterias de Salmonella gallinarum por ave. Los 35 pollitos restantes de cada grupo no se inocularon y permanecieron en estrecho contacto con las aves infectadas.

Los pollitos sin inocular de los grupos tratados con 25, 50 y 100 ppm no sufrieron infección hepática. En comparación con el Grupo A (sin tratar) la mortandad fue significativamente más reducida (p<0,05) en los grupos tratados con 50 ppm del desinfectante. Dosis más altas del desinfectante causaron mortandad muy elevada, posiblemente por inhibición de la flora normal.

De acuerdo con estos resultados, en brotes de Tifosis Aviar es recomendable administrar el desinfectante en el agua de bebida a razón de 50 ppm, enfatizando que no se deben aplicar concentraciones mayores. Dosis más altas generan efectos contraproducentes, posiblemente debido a la inhibición de la protección natural de la flora normal de las aves. Los desinfectantes en general deben ser estrictamente aplicados in vivo a las dosis recomendadas.

Palabras claves: aves, infección, N-alquil dimetil benzilo cloruro de amonio, Salmonella gallinarum, TIMSEN, Tifosis Aviar


Introducción

La Tifosis Aviar es una enfermedad específica de las aves, causada por Salmonella enterica serovariedad Gallinarum biovariedad gallinarum. Salmonella gallinarum está adaptada a algunas aves (pollos, pavos y faisanes) y no causa enfermedad en otros animales (Liu et al., 2002; Shivaprasad 2000). Las aves en crecimiento son más susceptibles a la Tifosis Aviar, aunque también se pueden afectar individuos muy jóvenes (Poppe, 1996). La enfermedad fue erradicada de Australia, América del Norte y la mayoría de los países de Europa mientras que en América Central y América del Sur aún se describen brotes de la enfermedad (Silva et al., 1985). Las pérdidas económicas causadas por la Tifosis Aviar pueden ser muy altas, no sólo por mortalidad, sino también por los costos veterinarios involucrados, eliminación de las aves muertas, saneamiento de las instalaciones infectadas, etc. La vacunación con bacterinas es ineficiente para controlar la enfermedad (Silva et al., 1981). Por ello, el uso de vacunas atenuadas preparadas con la cepa 9R brinda mejor protección, aunque en brotes de Tifosis Aviar esta medida por sí sola no basta para prevenir la enfermedad o eliminarla de un lote infectado. Para lograr este objetivo hay que eliminar los lotes afectados y aplicar un completo plan de desinfección antes de introducir animales libres en el establecimiento avícola. Este plan fue exitosamente llevado a cabo en varios países logrando así la erradicación de la Tifosis Aviar (Rabsch et al., 2000).

La morbilidad y mortalidad debidas a Tifosis Aviar dependen de distintas variables: raza, sexo, edad y estado nutricional de las aves, manejo de los lotes e infecciones concurrentes, factores climáticos, etc. Puede registrarse alta mortandad por Tifosis Aviar en gallinas ponedoras sin inmunizar pues estas aves son muy susceptibles al estrés de postura (Pomeroy & Nagaraja, 1991).

Debido al aumento de la resistencia bacteriana a drogas necesarias para el tratamiento de seres humanos, en los últimos años existe una gradual prohibición del empleo de los antibióticos como aditivos alimentarios para animales (Ciment, 1999; Wegener, 2003). La prohibición del uso de estas drogas deja un importante vacío en el arsenal disponible para la prevención de enfermedades animales. En los próximos años se esperan muchas más limitaciones al uso de antibióticos y quimioterápicos, medidas que irán gradualmente incrementando la lista de drogas de uso proscrito. Es, por lo tanto, necesario explorar nuevas formas preventivas de control que no sean nocivas, ni para la salud humana ni para el medio ambiente. Entre ellas puede citarse la aplicación de estrictas medidas de bioseguridad y desinfección para la prevención de la Tifosis Aviar y otras enfermedades infecciosas de las aves. A diferencia de los antibióticos, es menos frecuente que las bacterias desarrollen resistencia (Agolini & Grassi, 1996) y en esos casos este fenómeno es reversible (Miyagi et al., 2000), por lo cual en estos momentos serían las drogas de elección.

Este trabajo fue efectuado para determinar la dosis oral más adecuada del desinfectante TIMSENTM que sea capaz de prevenir la infección horizontal (contagio) de pollitos muy expuestos a Salmonella gallinarum.

Foto 1. Cubículos


Foto 2. Piso de los cubículos


Foto 3. Indumentaria utilizada

Materiales y Métodos

Animales Experimentales
Para los ensayos se usaron pollitos BB machos de gallinas ponedoras de color Gy (Great yield) - Brown (Cabaña Avícola La Mendocina, Argentina) libres de Salmonella spp. Todos los pollitos recién eclosionados se trasladaron de inmediato al INTA EEA de Balcarce, en condiciones de alta bioseguridad. Las aves fueron alojadas en una sala de ensayos con cubículos aislados, diseñados para ensayos con agentes patógenos bacterianos. Las aves fueron periódicamente analizadas para comprobar que permanecieron libres de Salmonella spp. desde la eclosión hasta el momento del desafío. En todos los ensayos los animales recibieron alimentos y agua ad libitum.

Cubículos, unidad experimental y medidas de seguridad
Cada grupo experimental de aves fue alojado en un cubículo separado. Estos cubículos están construidos con cemento y tienen puertas frontales metálicas con un vidrio central para observación de las aves desde el exterior (Foto 1).

La administración de agua se realizó mediante bebederos plásticos y los alimentos se administraron desde el exterior mediante un sistema especialmente adaptado de comederos. El piso tiene rejillas metálicas elevadas y situadas por encima del piso de cemento para prevenir el contacto de los animales con la materia fecal (Foto 2). Las heces se lavaron por arrastre con agua. La ventilación se suministró por aire en forma continua. La iluminación de cada cubículo es independiente y el sistema permite que las reparaciones puedan ser efectuadas desde el exterior. La calefacción ambiental general se proporcionó con calefactores a gas. Todos los cubículos están situados en un edificio aislado con entrada de personal a través de un sistema de vestuarios y duchas obligatorias. Una vez dentro de las instalaciones aisladas el personal técnico y auxiliar utiliza indumentaria blanca de gorros, overoles, botas, barbijos y guantes de látex descartables (Foto 3).

Cepa de desafío
Se utilizó la cepa patógena de Salmonella gallinarum INTA 91, conservada avianizada en nitrógeno líquido (-196°C), cuya dosis letal 50% (DL50) y patogenicidad in vivo para pollitos de 21 días fueron anteriormente determinadas por Audisio & Terzolo (2002).

Preparación de inóculo
La mencionada cepa se cultivó en placas de agar MacConkey y una sola colonia de este cultivo se usó para sembrar un frasco fermentador de caldo “tripticasa-soja”. El caldo fue incubado durante 18 horas a 37°C con agitación permanente. Después de la incubación se realizaron diluciones logarítmicas en base 10 (log10) y gotas de 20 µl de cada dilución se emplearon para efectuar un recuento de bacterias viables en superficie de agar MacConkey, según la técnica de Miles et al. (1938). En un pre-ensayo (datos no presentados) se seleccionó una dosis letal infectiva de 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por ave (Audisio & Terzolo, 2002).

Diseño Experimental
Se emplearon 390 pollitos de 21 días de edad, los cuales fueron divididos en 6 grupos experimentales (A, B, C, D, E y F) de 65 pollitos cada uno. Las aves de cada grupo fueron tratadas con diferentes dosis del desinfectante en el agua de bebida: las aves del Grupo A (control) no recibieron ningún tratamiento con el desinfectante; las aves Grupo B recibieron 25 ppm; las del Grupo C 50 ppm; las del Grupo D 100 ppm; las del Grupo E 250 ppm; y las del Grupo F 500 ppm.

Veinticuatro horas después de administrar el desinfectante, 30 de los 65 pollitos de cada uno de los grupos experimentales fueron oralmente desafiados con la cepa de Salmonella gallinarum. Los pollitos desafiados fueron identificados e inmediatamente inoculados en forma individual con 0,2 ml, depositados dentro del buche (109 UFC de SG) mediante una jeringa de tuberculina adosada a una cánula plástica. Los restantes 35 pollitos de cada uno de los grupos experimentales no fueron desafiados con Salmonella gallinarum y se mantuvieron dentro sus correspondientes cubículos en estrecho contacto con las aves experimentalmente infectadas. De este modo se utilizaron 30 aves por grupo para evaluar el desinfectante en una prueba de desafío por infección o contagio horizontal.

Para evaluar la invasión de Salmonella gallinarum y el contagio de los pollitos sin inocular, 20 pollitos de cada grupo, 10 inoculados y otros 10 sin inocular, fueron sacrificados al 5º día post-inoculación. Al 8° día post-inoculación se dio por finalizado el ensayo y se sacrificaron todas las aves restantes. La mortandad por Tifosis Aviar Se registró diariamente hasta la finalización del ensayo.

Cultivo de hígados
De cada uno de los pollitos se extrajo asépticamente una muestra de hígado. Para determinar si la Salmonella gallinarum estaba presente en el órgano se realizaron improntas directas del mismo sobre la superficie de placas de agar MacConkey. Después de la incubación durante 24 horas a 37°C, en todos los cultivos con desarrollo de Salmonella gallinarum, se determinó en distintas diluciones el desarrollo de la bacteria por gramo de órgano. Para ello se sembraron 20µl de cada una de 6 diluciones log10 sucesivas (desde 10-1 hasta 10-6), realizadas en caldo tetrationato a partir de 1 g de hígado. Previamente a su siembra el caldo tetrationato fue activado con solución de lugol y adicionado de verde brillante y novobiocina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Merck Química). Los caldos fueron incubados durante 48 horas a 37°C y posteriormente subcultivados en placas de agar MacConkey. Este método de enriquecimiento selectivo semi-cuantitativo sirvió para establecer resultados positivos o negativos para cada dilución log10, sin enumerar las colonias bacterianas que desarrollaron en cada una de ellas.


Estadística

Los resultados fueron analizados mediante la prueba exacta de Fisher. El valor de P<0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Todos los pollitos permanecieron libres de infección con Salmonella spp. hasta el momento del desafío.

El desarrollo bacteriano de los hígados que resultaron ser positivos a Salmonella gallinarum alcanzaron cifras máximas del orden de 104, 105 y 106 bacterias viables por gramo de órgano.

Salmonella gallinarum fue aislada de todos los pollitos inoculados y sacrificados al 5° día post-inoculación. Con respecto a los pollitos sin inocular y sacrificados simultáneamente al 5° día post-inoculación sólo se aisló a Salmonella gallinarum del hígado de una de las aves del Grupo F (500 ppm) y otra del Grupo A (control sin tratamiento). Los resultados al 8º día post-inoculación de los cultivos de los hígados de los restantes pollitos sin inocular de cada grupo se detallan en la Figura 1. Como puede observarse con 25, 50 y 100 ppm no hubo colonización del hígado mientras que con 250 ppm se obtuvieron cifras idénticas al Grupo A (12%) y ya con 500 ppm el número de hígados con aislamiento de Salmonella gallinarum fue mayor (20%) al Grupo A.

La mortandad se manifestó a partir del 5º día post-inoculación. En general solamente murieron los pollitos que habían sido inoculados. Salmonella gallinarum, que se aisló del hígado de todos los pollitos que murieron. La mortandad fue de 65%, 45%, 30%, 85%, 70% y 85% en los grupos A, B, C, D, E y F, respectivamente (Figura 2). Los resultados fehacientemente demuestran que en los Grupos A, D, E y F murieron significativamente más pollitos que en el Grupo C (50 ppm). La mortandad registrada en el Grupo B (25 ppm) no fue estadísticamente diferente de la registrada en los Grupos A o E, pero fue significativamente menor que la de los Grupos D o F.


Discusión

En este trabajo se realizó un ensayo para evaluar el efecto del TIMSENTM administrado en el agua de bebida a pollitos de 21 días de edad. La dosis recomendada para la aplicación del desinfectante es de 25 ppm y en este ensayo se trató de comprobar si esa dosis sería adecuada en aves muy expuestas al contagio y, además, conocer si la administración de dosis más altas pudieran haber sido mejores para proteger a los pollitos cuando un establecimiento avícola sufre un brote de Tifosis Aviar.

Los resultados obtenidos en este ensayo demuestran que la aplicación del desinfectante en la concentración de 25 ppm, dosis recomendada por el fabricante, reduce la mortandad y la infección natural de los pollitos, aunque sin embargo estas diferencias no fueron estadísticamente significativas con respecto al grupo control sin tratar. En cambio al aumentar la dosis a 50 ppm se incrementó notablemente la eficacia del desinfectante, siendo la mortandad un 35% inferior al grupo control no tratado, diferencias que son significativas (P<0,05).

Se encontró que la aplicación del desinfectante en concentraciones de 25, 50 ó 100 ppm (Grupos B, C y D) contribuyó a detener la infección hepática de los pollitos sin inocular y severamente expuestos al contagio de sus congéneres inoculados.

Si bien el aumento de la dosis de 25 ppm a 50 ppm es recomendable en el caso de que se presente una infección en las granjas, no se puede aumentar esta dosis en demasía, ya que concentraciones muy altas del desinfectante producen un efecto contraproducente pues aumentan la mortandad y la infección natural de los pollitos. Particularmente estos efectos fueron bien demostrados en los ensayos cuando los pollitos recibieron dosis de 250 ó 500 ppm del desinfectante en el agua de bebida.

Una explicación posible a este fenómeno es que el desinfectante afectaría a la flora normal del tracto digestivo de los pollitos. Cuando un pollito se infecta oralmente con Salmonella gallinarum este patógeno debe competir con otras bacterias que habitualmente colonizan el intestino. Cuando se administran concentraciones excesivamente altas del desinfectante, éste se comporta en el tracto digestivo como un bactericida general, eliminando tanto a las bacterias beneficiosas como a las patógenas. De este modo, Salmonella gallinarum puede colonizar e invadir con mayor facilidad y rapidez los órganos de las aves. Inclusive las aves carentes de flora beneficiosa se tornan aún más susceptibles a la inoculación experimental que las aves controles sin tratar. Asimismo, al eliminar completamente la flora normal competitiva de los pollitos expuestos a la infección, la mortandad por Tifosis Aviar y la infección natural con Salmonella gallinarum fueron significativamente más altas en los grupos tratados con 100, 250 y 500 ppm del desinfectante (Grupos D, E y F) que en el Grupo A (control).

Cabe señalar que este efecto adverso de los desinfectantes es posiblemente universal y los desinfectantes en general, cuando son aplicados in vivo en las aves, tienen como todas las drogas contraindicaciones por sobredosis y deben ser utilizados con la debida precaución, respetando estrictamente la posología que está relacionada con la forma de administración recomendada por cada fabricante.

De acuerdo con estos resultados, en casos de brotes de Tifosis Aviar es muy recomendable aumentar la dosis de TIMSENTM en el agua de bebida hasta 50 ppm. Es importante enfatizar que no se deben aplicar concentraciones mayores a las recomendadas pues las mismas incrementan la infección.



Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Dante J. Bueno del INTA EEA de Concepción del Uruguay por la revisión crítica, a Ramona Gollob de la universidad Reutlingen, Alemania. A Rosana C. Malena, María A. Méndez y Alejandra V. Velilla por las tareas realizadas en el laboratorio de bacteriología y a Abel H. Gulle y Cristian H. Gulle por los trabajos de crianza de las aves en las unidades experimentales.


Bibliografía

Notas

Notas

Notas