Evaluación de la digestibilidad in-vitro de aceite de soja y palma para su uso en avicultura

Introducción

Las grasas son ingredientes habituales en la formulación de piensos para avicultura dado su alto valor energético y su aporte en ácidos grasos esenciales. Uno de los principales factores que afectan al valor energético de una grasa es su digestibilidad. Es por ello que el estudio y conocimiento de los procesos de digestión y absorción de las materias grasas incorporadas en la dieta por parte del animal resulta de gran interés. La metodología comúnmente utilizada son los clásicos balances de digestibilidad in-vivo que conllevan el uso de animales y, muy frecuentemente, su sacrificio (Vilarrasa et al., 2014; Ravindran et al, 2016). Dichos balances van asociados a un elevado coste económico y de tiempo y sujetos a cierto grado de variabilidad inter-individual. Consecuentemente, existe gran interés en el desarrollo de herramientas útiles para la valoración de las materias grasas previa a su utilización in-vivo. Los ensayos de digestibilidad in-vitro, utilizados comúnmente en el ámbito de alimentación humana, presentan la ventaja de no utilizar animales, siendo métodos normalmente más rápidos y de menor coste económico. Así mismo permiten profundizar en los mecanismos físico-químicos que determinan su bioaccesibilidad.

El objetivo del presente estudio es evaluar el proceso de hidrólisis y la bioaccesibilidad de dos grasas con distinto grado de insaturación, habitualmente utilizadas en alimentación aviar. Ello permitirá una mayor comprensión de los procesos implicados en la digestión y absorción de las grasas y, por consiguiente, de las diferencias en digestibilidad in-vivo.

Material y métodos

Reactivos y materiales
El aceite de soja (S, insaturado) se adquirió de R.I.O.S.A (Linares-Baeza, España) y el aceite de palma (P, saturado) de Lipidos Santiga S.A. (Santa Perpetua de Mogoda, Barcelona, España), ambos objeto de estudio, se almacenaron a -20ºC hasta su utilización. Trizma, ácido maleico, pancreatina porcina, sales biliares y lecitina de yema de huevo se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany). Sodio sulfato anhidro, cloruro de sodio y cloruro de calcio de Panreac (Barcelona, España). Todos los disolventes utilizados para el HPLC-RID se obtuvieron de Scharlab (Sentmenat, Barcelona, España).

Digestión lipídica in vitro
El modelo de digestión in-vitro se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito por Martin et al., (2014) con algunas modificaciones. Básicamente, una muestra de 0,5 g de grasa fue dispersada en 27 mL de Trizma-maleato de 0,1 M a pH 7,5 (tampón) a 37ºC. Para simular la secreción biliar se incorporó a la mezcla 0,1 g de lecitina, 0,25 g de sales biliares, 0,5 mL de solución de CaCl2 a 325mM y 1,5 mL de solución de NaCl a 3,25 mM. La mezcla se pre-emulsificó y homogenizó durante 2 min a 3500 rpm. La simulación de la digestión intestinal se inició con la adición de extracto fresco de pancreatina (0,5 g de pancreatina porcina en 3 mL de tampón Trizma-maleato). La mezcla se mantuvo durante 60 minutos en un incubador orbital a 37ºC en constante agitación a 200 rpm. Con el objetivo de estudiar la evolución de los productos lipídicos a lo largo del proceso hidrolítico, se recogieron alícuotas (450 µl) por duplicado a 10, 30 y 60 min de digestión. La digestión in-vitro de cada aceite se realizó por triplicado.

Aislamiento de la fracción de micelas mixtas de la dieta
Se realizó una separación de las micelas mixtas de la dieta (DMM) de vesículas, otras gotas lipídicas y el resto de productos de la fracción hidro-solubles. Se llevó a cabo en una columna de Sepharose®4B (Sigma-Aldrich, Madrid, España) utilizando una fase móvil 0,5 M de NaCl y sales biliares (Sigma) según Gil-Ramírez et al., (2014). Para ello, la solución resultante posterior a los 60 min de digestión se pasó por un papel de filtro para eliminar las partículas aglomeradas. De la solución filtrada, se recogió 5 mL y se incorporaron en la columna junto con la fase móvil. La fracción correspondiente a DMM se recogió en forma de pool (20 mL) y posteriormente se analizó la composición lipídica.

Separación de fases tras la digestión lipídica in-vitro
Se realizó otra digestión con el fin de obtener distintas fases de acuerdo a Soler-Rivas et al. (2010). Para ello, después de 60 minutos de digestión, el medio se centrifugó a 4000 rpm durante 40 min a 37ºC. Tras la centrifugación se obtuvieron 3 fases, una fase superior oleosa (FO), una fase media acuosa micelar (FM) y una fase inferior precipitada (FP). En el caso de la FP se procedió al análisis de la composición lipídica. La digestión in-vitro para la separación de fases de cada aceite se realizó por duplicado.

Extracción lipídica
Los lípidos totales de las muestras se extrajeron mediante hexano:metil tert-butil éter (50:50, v/v) a una ratio de 3:1 (v/v) de disolvente respecto muestra (Martin et al., 2014). La mezcla se agitó durante 1 min y se centrifugó durante 10 min a 15000 rpm para las alícuotas a diferentes tiempos de digestión y a 4000 rpm para DMM y FP. Se llevó a cabo una segunda extracción con cloroformo:metanol (2:1, v/v) a una ratio de 3:1 (v/v) de disolvente respecto muestra. Las dos fases orgánicas obtenidas post centrifugación se recogieron y se les añadió sodio sulfato anhidro.

Análisis de productos lipídicos
La composición lipídica (TAG: Triacilglicéridos, DAG: Diacilglicéridos, MAG: Monoacilglicéridos, AGL: ácidos grasos libres) de cada muestra lipídica extraída de las alícuotas a diferentes tiempos (10, 30, 60 min), de las DMM y de la FP se determinó según la ISO 18395:2005 por cromatografía líquida de alta eficacia Agilent 1100 equipado con un detector de índice de refracción (HPLC-RID) a 35ºC. En cada una de las muestras extraídas se añadió 1 mL de tetrahidrofurano (THF), se homogeneizó y filtro a través de un filtro de nylon (0,45 µm) y se inyectó 100 µl (20 µl loop) en el cromatógrafo equipado con dos columnas Styragel (Phenogel HR1 y Stiragel HR 0.5) de 30 cm x 0,78 cm i.d., rellenas de partículas esféricas de copolimero styrenedivinilbenzeno, con un tamaño de partícula de 5 µm (Water Associates, Milford, MA, USA), conectadas en serie y ubicadas en un horno a 35ºC. La fase móvil consistió en 1 mL/min de THF. El tiempo 0 minutos se corresponde a la composición en productos lipídicos de los aceites S y P.

Análisis estadístico
Se comprobó la normalidad de los datos y la homogeneidad de la varianza. Los datos de Nivel de Lipolisis post-digestión se analizaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA) de una vía, mediante el programa R (versión 3.3.2; 2016). Se considera que las diferencias son significativas cuando p < 0,05.

Resultados y discusión

Evolución de productos lipídicos
En la Figura 1 se muestra la evolución de los productos lipídicos (TAG, DAG, MAG y AGL) generados tras la hidrólisis de S y P. En ambas grasas, los TAG son los productos lipídicos mayoritarios al inicio de la digestión. En general, a lo largo del tiempo de digestión se observó un descenso de TAG y paralelamente un aumento de AGL y en menor medida de MAG y DAG.

La mayor parte de la hidrólisis tuvo lugar en los primeros 10 minutos, donde los TAG se hidrolizaron, pasando al inicio de la digestión del 80 % (S) y 95 % (P), al 20 %. Los AGL, minoritarios al inicio de la digestión (S: 1%; P: 6%) llegaron a representar un 55 % de los productos lipídicos. Tanto los MAG como los DAG, constituyeron alrededor de un 10 % del total de los productos lipídicos.

Entre los 10 y los 60 minutos, la grasa continuó hidrolizándose pero con una tasa inferior. Al final de la digestión (60 min), los TAG representaron el 12 % (S) y el 8 % (P) de los productos lipídicos, lo que supuso una disminución de un 10 % respecto a los 10 minutos). Los AGL, por su parte, incrementaron en un 2,5 % para S y de un 8 % para P.

El hecho de que la mayor parte de la hidrolisis tenga lugar principalmente en los primeros 10 minutos concuerda con los resultados obtenidos por Martin et al. (2014) en aceite de oliva, y se ha relacionado con un proceso de saturación las micelas mixtas (Sek et al., 2002). Pese a que el comportamiento general de hidrólisis que se observó fue similar para ambas grasas, se obtuvieron algunas diferencias al final de la digestión. S presentó un mayor porcentaje de MAG (S: 17,2 %; P: 12,8 %) y menor de DAG (S: 8,9 %; P: 13,6 %) que P. La presencia de un mayor porcentaje de MAG en S podría mejorar la absorción de las grasas ya que facilitan la absorción de otros AGL (Ravindran et al., 2016).

Figura. 1. Evolución de productos lipídicos (% productos lipídicos/total productos lipídicos) durante la digestión intestinal in-vitro de S (aceite de soja) y P (aceite de palma). TAG (triacilglicéridos), DAG (diacilglicéridos), MAG (monoacilglicéridos), AGL (ácidos grasos libres). Los datos se presentan como valores medios (n = 3) ± desviación estándar.

La absorción de las grasas requiere la conversión de TAG y DAG en AGL y MAG como productos finales de la hidrólisis potencialmente absorbibles. Con el fin de comparar los productos lipídicos potencialmente absorbibles por parte del animal, se estimó el Nivel de Lipólisis (L%) de cada grasa objeto de estudio según Carrière et al. (2001). Para ello, se aplicó la fórmula siguiente: L% = 100 x (AGL + MAG)/(3 x TAG + 2 x DAG + MAG + AGL), teniendo en cuenta que de un TAG podemos obtener 1 DAG + 2 AGL y de un DAG, 1 MAG + 1AGL. Antes de la digestión, el % mol AGL+MAG era muy bajo para ambas grasas, si bien en S era menor que en P (Figura 2). No obstante, no se obtuvieron diferencias en L% al final de la digestión (60 min), indicando que la cantidad de productos potencialmente absorbibles es igual en S y P.

Figura. 2. Nivel de lipolisis (L%) estimado como productos lipídicos potencialmente absorbibles (% mol AGL+MAG) según Carrier et al. (2001) en Pre-digestión y Post-digestión (60 minutos) de S (aceite de soja) y P (aceite de palma). “Post-digestión”: diferentes letras sobre las barras marcan diferencias significativas (p < 0,05); los datos se presentan como valores medios (n = 3) ± desviación estándar.

Los resultados obtenidos no mostraron diferencias claras en cuanto al proceso de hidrólisis in-vitro entre las dos fuentes grasas (S, aceite insaturado y P, aceite saturado), pese a estar descrito que la actividad de la lipasa se ve influenciada por el grado de saturación, presentando las grasas saturadas una mayor complejidad en la unión con la lipasa pancreática (Vankuiken & Behnke, 1994), y por consiguiente dificultad en su hidrólisis.

Bioaccesibilidad de productos lipídicos
La bioaccesibilidad de cada una de las grasas se estudió en base a la FO (fase oleosa), FM (fase micelar) y FP (fase precipitada), con ello se pretende realizar una aproximación sobre la utilidad que tendrían estos aceites por parte del animal (Figura 3). Tras 60 min de digestión, la FO, fase que corresponde a la grasa no digerida, es prácticamente inexistente (0,1 %) en ambas grasas. Por el contrario, la FM es la fase mayoritaria. En esta fase es donde se encuentran las sales biliares junto con los productos lipídicos generados tras la digestión, principalmente MAG y AGL formando micelas mixtas, micelas, vesículas o gotas lipídicas (Fatouros et al., 2007), siendo pues considerada como la fase potencialmente bioaccesible. Los resultados mostraron que tanto S como P son grasas con una elevada bioaccesibilidad (FM > 90 %), si bien S presentó una FM mayor frente a P (S: 97,4 %; P: 92,17 %) y una menor fracción no bioaccesible (FP) (S: 2,50 %; P: 7,69 %).

Figura. 3. Porcentaje de las fases aisladas tras 60 min de digestión intestinal in-vitro de S (aceite de soja) y P (aceite de palma). FO (Fase Oleosa), FM (Fase Micelar), FP (Fase Precipitada). Los datos se presentan como valores medios (n = 2).

El análisis de las fracciones lipídicas de las micelas mixtas (DMM, contiene los productos lipídicos potencialmente absorbibles) presentes en la FM (fase bioaccesible) y de la FP (fase no bioaccesible) se presentan en la Figura 4. La grasa recuperada correspondiente a la fracción de micelas mixtas (DMM) en S (46,3 mg) fue mayor que en P (23,0 mg) (Figura 4a). No obstante, la composición en productos lipídicos expresados en porcentaje, fue similar en ambas grasas para AGL (S: 64,9 %; P: 61,9 %), MAG (S: 26,2 %; P: 25,2 %), TAG (S: 0,9 %; P: 1,8 %) y DAG (S: 7,8 %; P: 10,8 %). En cuanto a la FP (Figura 4b), se observó que la cantidad de grasa recuperada fue menor en S (46,9 mg) que P (141,4 mg). En cuanto a las fracciones lipídicas de la FP, S presentó menor porcentaje de TAG (S: 4,9 %; P: 13,6 %) y de AGL (S: 66,7 %; P: 73,0 %) que P, en cambio un mayor porcentaje de DAG y MAG (un 5,6 % y un 9,4 % más).

Figura. 4. Distribución de los productos lipídicos (% productos lipídicos / mg grasa total recuperada) a lo largo de a) micelas mixtas (DMM) de la FM y b) FP en S (aceite de soja) y P (aceite de palma). Los datos se presentan como valores medios (n = 2).

Los resultados observados en la Figura 3 y 4 indican que ambas grasas son muy bioaccesibles, aunque S en mayor medida que P. Sin embargo, el mayor porcentaje de FM, junto con una mayor cantidad de grasa formando parte de las DMM indicarían una mayor bioaccesibilidad y consecuentemente mayor biodisponibilidad de S respecto a P. Esto podría explicarse por el grado de saturación que presenta cada grasa, ya que las grasas insaturadas (S) forman las micelas mixtas con mucha más facilidad que las grasas saturadas (P) (Freeman, 1969). Por el contrario, P presentó más grasa precipitada, posiblemente debido al punto de fusión más elevado en P que S (Small, 1991).

Según los resultados obtenidos en este estudio preliminar de digestión intestinal in-vitro, S y P no parecen tener diferencias importantes en cuanto al proceso de hidrólisis, pero sí presentan diferencias en cuanto a la bioaccesibilidad, relacionada directamente con la absorción de estas grasas por parte del animal. Tancharoenrat et al., (2014) y Vilarrasa et al., (2014), coincidieron en que las grasas insaturadas presentaron mayor digestibilidad que las grasas saturadas estudiadas en pollos broilers. Sería necesario establecer una correlación entre los resultados obtenidos in-vitro y los obtenidos en estudios in-vivo, que permita asegurar que los resultados extraídos de un modelo in-vitro reflejaran los que se obtendrían en un estudio in-vivo, de manera que los ensayos in-vitro sirvieran como modelos de predicción del uso de las grasas en avicultura. No obstante, hay que tener en cuenta que la simulación de los procesos fisicoquímicos y fisiológicos del tracto digestivo de las aves puede resultar más compleja que en humanos ya que la digestión y velocidad de paso a través del tracto intestinal de las aves no es unidireccional, debido a los movimientos de retroceso (Angel et al., 2013).

Agradecimientos
El presente estudio ha sido financiado, en parte, por una beca predoctoral de Formación de Personal Investigador (FPI) concedida por el Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España y por el proyecto (CICYT AGL2015-64431-C2-1-R) concedido por la Comisión Interministerial de Ciencias y Tecnología de España del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España.

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