Multi-mycotoxin Analysis Using Immunoaffinity Column Clean-up and LC-MS/MS Determination

Estimado Sr. Kaplan: Yo estuve en la IUPAC meeting en Estambul, y justamente allí vi presentado este poster en un stand comercial. Muchas gracias por retransmitir las preguntas a la Dr. MacDonald, sobre todo lo que más me llamó la atención fueron las recuperaciones con esa solución extractiva, yo tampoco soy una experta en LC-MS, pero el tema de la preparación y extracción de las muestras, así como el clean-up es química analítica básica para el tema de micotoxinas, por eso también realicé la pregunta directamente al foro. Aguardo entonces los comentarios que serán muy clarificadores. Nuevamente muchas gracias. Saludos

Estimada Patricia, dado que no soy el autor del trabajo, ni tampoco un experto en LC/MS-MS, le transmitiré tus comentarios e interrogantes a la Dra. MacDonald y luego los re-transmitiré al foro. Sin embargo entiendo que hay algunos conceptos a aclarar respecto a los puntos mencionados en tu respuesta: Este es un trabajo presentado en un congreso. No es aún un producto comercial. Los resultados presentados son preliminares y se está trabajando con otras matrices y residuos. Los valores de recuperación, hasta donde yo entiendo, incluyen la eficiencia extractiva del solvente de extracción y de la columna. Las comparaciones que has realizado fueron hechas sobre un resultado de baja recuperación para el DON en avena. Sin embargo se ha presentado en el mismo trabajo, la alternativa de trabajar con un volumen menor de extracto obteniéndose recuperaciones mayores al 90 %. Saludos, Dan Kaplan

Tengo algunos comentarios y dudas respecto al póster de la Dr. MacDonald presentado en la IUPAC (Multi-mycotoxin analysis using immunoaffinity column clean-up and LC/MS/MS Determination). 1. La primer pregunta es acerca de la recuperación y el solvente seleccionado para la extracción, ya que solamente han realizado un spike de los extractos para probar la recuperación de la columna, pero la solución de extracción seleccionada (75 % de metanol), es una de las que menor eficiencia de extracción ha presentado, según la publicación referenciada en este trabajo: Development and validation of a liquid chromatography/ tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize [Sulyok, M., Berthiller, F., Krska, R. and Schuhmacher, R., 2006, Rapid Commun. Mass Spectrom., 20, 2649-2659] sobre todo si se compara con la clásica solución de extracción que se utiliza para otros métodos: 84 % acetonitrilo. Por ejemplo, en el póster se ha presentado la recuperación de la columna para el caso de avena: DON: 63,2% HT2: 99,5% T2: 88,6% ZON: 89,3% Pero, si incluimos la recuperación obtenida a partir de la matriz, es decir la eficiencia de la solución extractiva (Metanol al 75%), vemos que la suma de los valores de recuperación podría estar fuera de los aceptables para micotoxinas según la Unión Europea, (60 a 110 %). Al no encontrar en este trabajo los datos de eficiencia de la solución de extractiva, si extrapolamos los datos que aparecen en el trabajo de Sulyok (referencia) referidos a trigo y maíz, vemos los valores de recuperación de la matriz obtenido por Sulyok et al: *Metanol al 75 %: DON: 54 ± 9 % HT2: 71 ± 10 % T2: 55 ± 1 % ZON: 39 ± 12 % Es decir, que por ej para el DON se tiene una recuperación en la extracción del 54 % y esto se pasa por la columna IAC, donde la recuperación es del 63,2% al final, el valor de la concentración del DON resultante será un 34 % del total de DON presente realmente en la muestra. Para el caso de la solución de extracción 84% acetonitrilo, los valores de recuperación obtenidos por Sulyok et al son: *Acetonitrilo al 84 %: DON: 106 ± 9 % HT2: 100 ± 9 % T2: 98 ± 8 % ZON: 106 ± 5 % RESUMIENDO, las preguntas a este punto son: 1.a. ¿Podríamos obtener por favor los datos de recuperación de eficiencia extractiva de las matrices que han sido trabajadas en este póster (avena, etc), a fin de complementar con los valores que ya presentaron de recuperación de las columnas? 1.b. ¿Qué datos obtuvieron al utilizar la mezcla más eficiente de solventes (84 % acetonitrilo) en cuanto a las recuperaciones? ¿o es un problema de esta columna de inmunoafinidad que no tolera una solución con acetonitrilo? 2. El segundo punto es acerca de las toxinas obtenidas con esta columna de inmunoafinidad. En el abstract solamente se menciona a las toxinas DON, T2, HT2 y Zearalenona. Es sabido que hay otros metabolitos de interés como ser Nivalenol (que está contemplado en el REGLAMENTO (CE) No 856/2005), además de los acetil derivados del DON, DAS, T-2 tetraol, T-2 triol, etc. Y la tendencia en los métodos de LC-MS/MS, es obtener en un solo extracto la mayor cantidad de metabolitos posibles, tal como se presentan en las numerosas publicaciones que utilizan columnas multifuncionales (MycoSep) o en aquellas sin clean-up previo como la mencionada referencia de Sulyok. La pregunta es ¿Cuáles son los datos de obtención de otros tricotecenos y fusariotoxinas con esta columna de inmunoafinidad? Si no pueden lograrse otros metabolitos, ¿que solución pueden brindar al usuario para un screening de tricotecenos si no pueden obtenerse con una única columna de inmunoafinidad? 3. El tercer punto es en cuanto al tiempo y costos insumidos en la técnica, ya que la utilización de una columna de inmunoafinidad siempre consume mayor cantidad de tiempo, sobre todo en este caso que se requiere el acondicionamiento, pasaje de 50 ml de solución, lavado y elusión (esto lleva en las mejores condiciones unos 20 minutos) y si se trabaja con columnas multifuncionales este tiempo es de 30 segundos. Con respecto a los costos, se obtienen mayor número de metabolitos utilizando una columna multifuncional (MycoSep) o incluso sin cleanup previo que con una columna de inmunoafinidad. Otro aspecto que insume mucho tiempo, y es mencionado en el póster, es la calibración asistida con matrices. ¿Por qué no se utilizó un Standard interno totalmente marcado con isótopos, que es la tendencia actual? Agradezco desde ya las respuestas y comentarios a estos interrogantes.