Análisis molecular de la secuencia del gen ATAQ en aislados mexicanos de la garrapata rhipicephalus microplus

La ganadería bovina que se desarrolla en regiones tropicales y subtropicales del mundo, está constantemente expuesta a las infestaciones por garrapatas Rhipicephalus microplus. Los efectos causados por esta especie de garrapata representan uno de los principales problemas que repercuten en la productividad del ganado, sin olvidar el papel que juegan en la transmisión de enfermedades como babesiosis (Babesia bovis, Babesia bigemina) y anaplasmosis (Anaplasma marginale) (Molento et al., 2013). Se estima que el costo global ocasionado por las garrapatas y las enfermedades que transmiten oscila entre los 2.5 billones de dólares anualmente (Lew-Tabor et al., 2014) y en el caso concreto de México se menciona que el cálculo es de 573 millones de dólares anuales (Rodríguez-Vivas et al., 2017). Actualmente, existen distintos métodos de control de garrapatas en campo con efectividad variable. El control químico, con base en el uso de ixodicidas es el más utilizado a la fecha. Sin embargo, el uso excesivo, frecuente e inadecuado de estos productos ha seleccionado cepas de garrapatas resistentes a diversas familias de ixodicidas. Tal es el caso de explotaciones localizadas en regiones como Veracruz y Tamaulipas donde existe el fenómeno conocido como multiresistencia (Fernández et al., 2012). Los métodos inmunológicos por medio de vacunas están trascendiendo ya que tienen eficacia cuando se utilizan estratégicamente reflejándose en la disminución de poblaciones y en los parámetros reproductivos de las garrapatas. La caracterización, secuenciación y análisis de genes/proteínas a partir de cepas o aislados locales de R. microplus, será una herramienta de importancia para el diseño y desarrollo de inmunógenos, los cuales podrían ser incorporados como un componente más dentro de un programa de control integrado contra garrapatas. Por lo anterior, el objetivo de este estudio consiste en secuenciar y analizar el gen ATAQ de la garrapata R. microplus, a partir de distintos aislados mexicanos, que sirva de base para el diseño de una vacuna en futuros experimentos de inmunización en bovinos.

Se utilizaron cinco aislados mexicanos de garrapatas R. microplus, de entre las cuales se encuentran dos cepas que se mantienen en condiciones controladas en el CENID-PAVET, INIFAP; la cepa denominada “Media Joya” (MF314445.1) colectada originalmente en Tapalpa, Jalisco y la cepa “Huastecas” (MF314447.1) colectada en Aldama, Tamaulipas. Los otros 3 aislados corresponden con garrapatas R. microplus de Zacatecas (MF314446.1), Nayarit y Campeche. Las secuencias codificantes del gen ATAQ de los cinco aislados mexicanos fueron obtenidas de acuerdo con la metodología descrita por Juárez et al. (2016). La base de datos del GenBank se utilizó para obtener las secuencias del gen ATAQ reportadas para la garrapata R. microplus de distintos aislados geográficos, así como de diferentes géneros de garrapatas. El análisis de alineamiento múltiple se realizó con los programas CLUSTAL W http://www.genome.jp/tools/clustalw/, UGENE http://ugene.net/, MUSCLE http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/muscle/ y T-Coffee http://tcoffee.crg.cat/ utilizando métodos progresivos e iterativos con la finalidad de comparar los resultados y evaluarlos para obtener el mejor alineamiento. Para analizar la calidad de los alineamientos se utilizó el programa GeneDoc http://www.nrbsc.org/ old/gfx/genedoc/ calculando la suma de pares y LogOdds. Finalmente, se detectaron regiones conservadas y mutaciones puntuales presentes en las secuencias del gen.

Se generó una matriz de sustitución para identificar el grado de identidad/similitud que existe entre los diferentes aislados geográficos de R. microplus, así como para los diferentes géneros de garrapatas, a través del servidor SIAS http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html diseñado por la Universidad Complutense de Madrid. El análisis filogenético se llevó a cabo usando el programa MEGA 7, para el cual se consideraron diferentes secuencias codificantes de ATAQ bajo los siguientes parámetros: como modelo de sustitución aminoacídica se utilizó el método Kimura 2 parámetros con sitios invariables (K2+l) elegido con base en el valor obtenido por el criterio de información Bayesiana. Como método de reconstrucción filogenética se utilizó el de máxima verosimilitud, como método de soporte estadístico se utilizaron 500 réplicas de bootstrap y como grupo externo se consideró la secuencia que codifica para el gen ATAQ de la garrapata Haemaphysalis helliptica (GU144598.1).

Se obtuvieron del GenBank 10 secuencias de diferentes especies de garrapatas, que codifican para el gen ATAQ, reportadas en Mozambique, Sudáfrica, Estados Unidos, Israel, Holanda y Francia para realizar el estudio de sustitución del gen ATAQ utilizando la matriz de identidad/similitud (Cuadro 1). El análisis mostró valores de 98.1-99.8% de identidad y similitud para las garrapatas pertenecientes al género R. microplus, mientras que para los diferentes géneros de garrapatas los resultados fueron muy variables. Este resultado revela un elevado grado de conservación y por ende una estructura muy similar entre los aislados mexicanos de R. microplus con el reportado en el GenBank (Mozambique: GU144589.1). La construcción del árbol filogenético muestra 6 clados o grupos estadísticamente definidos, que corresponden a los géneros: Rhipicephalus spp., Hyalomma spp., Dermacentor spp. y Haemaphysalis spp. 11 de las secuencias analizadas se agrupan dentro del clado de Rhipicephalus spp. mostrando una identidad de 89% entre los diferentes aislados geográficos de este género (Fig. 1). La especie R. microplus de aislados mexicanos se agrupa en un clado bien definido con la cepa “Mozambique” y estrechamente relacionada con la cepa “Israel” de R. annulatus calculando una identidad ≥98%, lo cual sugiere que es un gen conservado en estas especies.

La búsqueda de nuevos antígenos para desarrollar vacunas anti-garrapatas ha ido en avance y se han caracterizado nuevos genes con diferente mecanismo de acción; sin embargo, solo algunos inmunógenos derivados de estos, han mostrado eficacia en ensayos de inmunización contra aislados geográficamente distantes de garrapatas. La vacuna comercial constituida por el antígeno Bm86 demostró cierta eficacia contra R. microplus. Sin embargo, el polimorfismo del gen entre cepas de garrapatas, según la localización geográfica, podrían provocar ineficiencias de la vacuna ya que se ha demostrado que variaciones superiores al 2.8% en la secuencia de aminoácidos son suficientes para que la vacuna sea ineficaz (García-García et al., 1999). El gen ATAQ analizado y secuenciado de garrapatas R. microplus en distintas zonas de México podría ofrecer el mismo efecto protector que el antígeno Bm86, pero con la diferencia que podría poseer un elevado grado de conservación entre los diferentes aislados geográficos, siendo un candidato potencial a vacuna (Nijhof et al., 2010; Aguirre et al., 2016). El desarrollo de una vacuna eficaz contra garrapatas R. microplus diseñada a partir de genes conservados con mínima variabilidad, podría generar una protección inmune contra especies de garrapatas de diferentes regiones del mundo y ser económicamente más viable.

Se obtuvieron las secuencias codificantes del gen ATAQ a partir de 5 aislados mexicanos de garrapatas R. microplus, las cuales fueron analizadas molecularmente para determinar el grado de conservación con respecto a la cepa “Mozambique” publicada previamente en el GenBank. Se concluye que ATAQ es un gen altamente conservado en la especie R. microplus, observando ≥98% de identidad y similitud. El análisis molecular de genes conservados permitirá tener evidencia imprescindible para diseñar y sintetizar antígenos candidatos a vacunas contra garrapatas. Finalmente, el uso de vacunas vislumbra ser un método efectivo para mejorar la salud animal, abatir la contaminación ambiental y reducir el uso intensivo de ixodicidas.