Resistencia en parásitos gastrointestinales a los antihelmínticos en ganado para carne en Uruguay

INTRODUCCIÓN

Los sistemas de cría vacuna en nuestro país son mayormente pastoriles, lo que conlleva a que las parasitosis gastrointestinales (PGI) sean endémicas y estén presentes a lo largo de todo el año. El ganado vacuno es susceptible a dichos parásitos en las etapas jóvenes y al llegar su edad adulta desarrollan una buena inmunidad.

Los estudios de relevamiento de presencia y distribución de los PGI de bovinos en Uruguay son escasos y no han sido actualizados. Los trabajos publicados en la década de los 90 describen la coexistencia de infestaciones mixtas a través del año, siendo Cooperia spp. la más abundante durante el invierno seguida por Ostertagia sp. al final del verano. Otros PGI presentes son Haemonchus sp., Trichostrongylus spp. y Oesophagostomum spp.

Figura 1 - Mini-Flotac.

Tradicionalmente, Ostertagia ostertagi ha sido considerada una de las especies más patógenas para los terneros de destete y sobreaño. Últimamente, el desarrollo de resistencia a las ivermectinas por parte de Cooperia spp. ha llevado a un cambio en los conocimientos epidemiológicos disponibles, ya que ambos parásitos producen sintomatología clínica similar.

Al igual de lo sucedido en ganado ovino, el uso de drogas de amplio espectro como única medida de control, ha llevado al desarrollo de cepas de PGI resistentes. El primer informe de resistencia de Cooperia spp. a ivermectina en Uruguay fue realizado por Salles y col. en 2004. Luego, varios informes de laboratorio indican que dicha resistencia ha ido en escalada, afectando a otras especies parasitarias y drogas antihelmínticas.

PRINCIPALES OBJETIVOS DEL PROYECTO

1 - Estudiar y cuantificar la resistencia a los antihelmínticos en los PGI en bovinos para carne.

2 - Poner a punto técnicas moleculares para identificación de los PGI para complementar las informaciones resultantes de las clasificaciones fenotípicas de los mismos.

3 - Analizar los principales PGI presentes en los rodeos de cría mediante secuenciación masiva del segmento ITS-2 del ADN (metabarcoding).

4 - Identificar marcadores de resistencia incipiente a bencimidazol mediante secuenciación.

METODOLOGÍA

Para los objetivos planteados, se diseñó un estudio longitudinal y los muestreos se realizaron durante los años 2018-2020.

La eficacia antihelmíntica fue evaluada utilizando el test de reducción del conteo de huevos (TRCH) o "Lombritest".

Las drogas evaluadas fueron ivermectina (IVM), 200 µg/ kg peso vivo; ricobendazol (RBZ), 4 mg/kg pv; levamisol (LEV) 10 mg/kg pv y fenbendazol (FBZ), 5 mg/ kg pv. Adicionalmente, la eficacia a bencimidazol fue estudiada in vitro utilizando la técnica de inhibición de eclosión de huevos (EHT en inglés) y por secuenciación de marcadores de resistencia en el isotopo 1 de β-tubulina de ADN de larvas infestantes (L3).

Trabajo de campo

Una vez seleccionados los establecimientos, previa coordinación con el Médico Veterinario del mismo, se realizó un muestreo previo para asegurar que los animales tuviesen una carga parasitaria adecuada con valores de HPG ≥ 150. Al día 0 pretratamiento, se formaron grupos de 15 bovinos jóvenes de la misma categoría (terneros o sobreaños). Al pasar por el tubo, los animales fueron asignados al azar a los siguientes tratamientos: Control (CTRL), IVM, LEV, RBZ o FBZ. Se tomó muestra de materia fecal directamente del recto de cada animal y fueron dosificados con el antihelmíntico correspondiente, excepto por el grupo control sin tratar. Adicionalmente, se formó un pool de muestras que fueron acondicionadas en anaerobiosis para la prueba de EHT. Al día 14 postratamiento, se tomó otra muestra de materia fecal de cada participante en forma individual.

Trabajo de laboratorio

Los trabajos de laboratorio fueron realizados en el Laboratorio de Sanidad Animal de INIA Tacuarembó. Las secuenciaciones para metabarcoding (nemabioma) y resistencia molecular a bencimidazol fueron realizados en el Facultad de Veterinaria de la Universidad de Calgary, Canadá.

Los HPG se realizaron mediante el método de Miniflotac con límite de detección de cinco HPG (Figura 1). Los coprocultivos se realizaron siguiendo protocolo de Corticelli Lai, utilizando un pool de materias fecales formando pools para cada grupo. Un total de 100- 200 larvas infestantes (L3) fueron clasificadas morfológicamente siguiendo las claves de van Wyk y Mayhew (2013). Los trabajos moleculares se realizaron con ADN extraído de las L3.

Se aseguró que los animales tuvieran una carga parasitaria con valores de HPG ≥ 150. Se formaron grupos de 15 bovinos jóvenes de la misma categoría y, al pasar por el tubo, los animales fueron asignados al azar a los diferentes tratamientos.

El método de EHT fue realizado siguiendo la técnica de Demeler y col. (2012).

Análisis e interpretación de resultados

Para el cálculo de eficacia de las drogas (% reducción del conteo de huevos– %RCH) se utilizó la fórmula descripta por Dash y col. (1988) basada en la media aritmética de los HPG del grupo control (C) y tratado (T):

% RCH = 100 × (1-[T2/T1]/[C1/C2])

PRINCIPALES RESULTADOS

En el trabajo fueron incluidos un total de 43 establecimientos.

Los resultados presentados en el Cuadro 1 muestran falla en la eficacia de la IVM en todos los establecimientos y la presencia de resistencia a los demás grupos químicos en una alta proporción de establecimientos de cría vacuna.

La eficacia promedio fue 30,8 %, 90,5 %, 92,7 % y 92,9 % para IVM, LEV, RBZ y FBZ, respectivamente.

Resistencia múltiple (más de un grupo químico) fue encontrada en 44,2 % de los predios, donde 23,3 % presentó resistencia a dos grupos y 20,9 % a los tres grupos químicos.

Se encontró resistencia múltiple (más de un grupo químico) en 44,2 % de los predios, con 23,3 % de resistencia a dos grupos y 20,9 % a los tres grupos químicos.

La clasificación morfológica de las L3 recuperadas de los coprocultivos (n=43 establecimientos y n=258 coprocultivos) indicaron infestaciones mixtas tanto en los grupos pre y post tratamiento. Los géneros parasitarios predominantes fueron Cooperia spp, Haemonchus spp. y Trichostrongylus spp., seguido por Ostertagia sp. (Figura 2).

Resultados moleculares

La Figura 3 muestra la distribución por establecimiento (n=12) de especies parasitarias identificadas antes del tratamiento. La especie predominante fue Cooperia puntacta, seguida en menor proporción por Ostertagia ostertagi y Trichostrongylus axei.

Figura 4 - Composición de especies de parásitos gastrointestinales identificadas el día 14 postratamiento, agrupadas por grupos y promedio de los 12 establecimientos estudiados mediante nemabioma metabarcoding.

Figura 5 - Larvas infestantes de nematodos gastrointestinales.

Los resultados de las secuenciaciones de las L3 recuperadas el día 14 postratamiento indicaron que Cooperia puntacta es la principal especie resistente a ivermectina y en menor proporción a bencimidazol y levamisol. Ostetagia ostertagi se encontró en mayor proporción en los grupos tratados con levamisol y ricobendazol en comparación con ivermectina.

Detección molecular de resistencia a bencimidazol

Los resultados de secuenciaciones de marcadores de resistencia revelaron la presencia de mutaciones asociadas al codón 167Y y 200Y del isotipo 1 de β-tubulina, encontrado comúnmente en Haemonchus contortus y el marcador 200Y en Ostertagia ostertagi (resultados no publicados).

Detección de resistencia in vitro a bencimidazol

El test de inhibición de la eclosión de huevos para detección de resistencia in vitro a bencimidazoles, se realizó en 28 establecimientos. El promedio de inhibición de eclosión de huevos (EC₅₀) fue de 0,035 µg/ml y un establecimiento presentó baja eficacia de (EC₅₀=0,13 µg/ml).

PRINCIPALES CONCLUSIONES

La resistencia antihelmíntica está presente en 100 %, 32,2 %, 25,6 % y 10,8 % de los establecimientos para ivermectina, levamisol, ricobendazol y fenbendazol, respectivamente.
Las infestaciones encontradas en pre y postratamiento fueron mixtas en todos los establecimientos y la especie predominante fue Cooperia puntacta, identifcada por secuenciación. Este parásito produce principalmente pérdidas en las ganancias de peso de los terneros y sobreaños, por lo que se debe tener especial consideración en el manejo de estas categorías.
Por lo que sabemos, esta es la primera vez que se identifican mutaciones asociadas al codon 167Y y 200Y de β-tubulina común en Haemonchus contortus y resistencia emergente en Ostertagia ostertagi a bencimidazoles (200Y), en Uruguay.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó como parte del proyecto INIA CL_37 "Estudio de resistencia a los antihelmínticos en nematodos gastrointestinales en bovinos, en Uruguay".

Agradecemos especialmente a los productores que colaboraron con nuestro trabajo y a los médicos veterinarios de ejercicio liberal.