La criopreservación afecta tanto la estabilidad de la Actina como de la PLC-Z en el espermatozoide de bovino

La crioconservación es el método más eficiente para la conservación a largo plazo de los espermatozoides de mamíferos, sin embargo, a la fecha, aún con las mejores técnicas de preservación la sobrevivencia de la población espermática después del congelamiento es cercana al 50% [1,2]. Nuestro grupo ha sido el primero en señalar que los daños ocasionados por este proceso involucran a la teca perinuclear (TP) [3]. La TP es una estructura del citoesqueleto que rodea al núcleo del espermatozoide de los mamíferos [4]. De las proteínas citoesqueléticas, la actina ha sido detectada en la TP de todos los espermatozoides estudiados; se sabe que a medida que avanza la capacitación la actina concentra varias proteínas dentro de la TP, además de participar en el tráfico durante la reacción acrosomal (RA) [5]. La PLC-ζ, también localizada en la TP [6] es señalada como el factor espermático activador del óvulo [7,8,9,10]. De hecho, en el espermatozoide de humano se ha encontrado que anormalidades en la localización de PLC-ζ llevan a una menor activación del óvulo [11]. En hámster y ratón se ha reportado que cambios en el patrón de distribución de la PLC-ζ en los espermatozoides capacitados con RA, permiten de alguna forma la reubicación de la proteína en el sitio de la cabeza del espermatozoide donde se da la unión del espermatozoide con la membrana del óvulo [12]. Recientemente hemos encontrado que la dinámica del citoesqueleto de actina controla la migración de la PLC-ζ durante la capacitación y conduce a su liberación parcial en los espermatozoides con RA. En el caso de los espermatozoides criopreservados, encontramos que la actina presenta alteraciones tanto en su patrón de localización como de agregación [13,14] e in vitro, la capacitación y reacción acrosomal (RA) en los espermatozoides criopreservados se vieron afectadas y estrechamente relacionadas con las alteraciones de la TP [15]. Por ello, no descartamos que los efectos sobre la reorganización del citoesqueleto de actina influyan sobre la PLC- ζ. Por lo que, como un primer paso, el propósito de esta investigación es evaluar si los cambios en el citoesqueleto de actina que se presentan en el espermatozoide después del proceso de criopreservación están asociados con cambios en la localización de la PLC-ζ; esto para determinar si los cambios en el citoesqueleto de actina que se presentan en el espermatozoide después del proceso de criopreservación alteran las respuestas celulares durante el proceso de capacitación y RA, para con ello a futuro formular un diluyente que permita mantener la estabilidad del citoesqueleto de actina de la TP en los espermatozoides sometidos al proceso de congelación-descongelación.

 

Evaluar en la especie bovina si los cambios del citoesqueleto de actina que se presentan en los espermatozoides después del proceso de criopreservación están asociados con cambios en la localización de la PLC-ζ.

 

Se obtuvo muestra espermática por eyaculado y se trasladó al laboratorio de Morfología de la FMVZ de la UNAM en solución de triladyl/yema de huevo a 37°C. A su llegada se les realizó evaluación de la viabilidad, motilidad progresiva y concentración espermática. Posteriormente la muestra fue sometida a 3 lavados con PBS, para a continuación ser dividida en 4 muestras diferentes: espermatozoides frescos, espermatozoides capacitados (incubados por 4 h a 39°C en medio TALPm), espermatozoides con RA (incubados por 5 h a 39°C en medio TALPm suplementado con A23187) y espermatozoides crioconservados, los cuales también fueron sometidos a capacitación y RA.

Se realizaron frotis de todas las muestras, posteriormente se hidrataron en pases rápidos en alcohol a concnetraciones descendentes (100, 90, 96, 80 y 70%), enseguida se permeabilizaron con TBT por 1 h y 30 min, luego se les realizó 3 bloqueos de 10 min cada uno con peroxidasa al 3% en PBS, posteriormente se bloquearon con el Kit comercial Background Sniper (Biocare Medical) por 30 min, en seguida se sometieron a la primera reacción antigénica (actina y PLC-ζ) toda la noche a 4°C. Las muestras fueron lavadas con PBS, PBS-Tween-20 (1%) y TBS, seguidamente se les trato con el Kit comercial Starr Trek Universal HRP Detection System (Biocare Medical), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Después se realizó el revelado con 50 µl de DAB por 20 s para el caso de PLC-ζ y de 10 min para actina. Finalmente se realizó una contra-tinción con hematoxilina por 20 s, se deshidrataron las muestras con pases rápidos en distintos porcentajes ascendenetes de alcoholes, xilol y se montaron las laminillas para su observación al microscopio.

 

El análisis del patrón de localización de PLC- ζ en los diferentes estados fisiológicos del espermatozoide, mostró que en los espermatozoides frescos (EF) la proteína se localizó principalmente en la región subacrosomal de la TP (Sa; 39.4%) y en la región acrosomal (Ac; 20.2%), mientras que, en este mismo tipo de células, pero capacitadas (FC) y con RA (FRA) fue 54% Sa, 29.3% Ac y 52% Sa y 16.5% Ac desprendiéndose, respectivamente. Por otra parte, en los espermatozoides descongelados no capacitados (ED) la proteína se localizó 77% Sa y 24% Ac desprendiéndose, mientras que en los descongelados capacitados (DC) 61.9% fue Sa y 11.9% en la región post-acrosomal (Pa) y en espermatozoide descongelado con RA (DRA) se localizó un 57% Sa y un 24.1% en la Pa. Los resultados muestran que existe un cambio de localización de la PLC- ζ dependiendo del estado fisiológico del espermatozoide y que dicho patrón cambia en las céulas criopreservadas, donde el patrón inicial (espermatozoides decongelados) corresponde a los espermatozoides frescos capacitados. De manera importante en los espermatozoides FRA se muestra un patron en donde aparentemente se esta liberando a la PLC-ζ (Ac desprendiéndose). Cabe señalar que independientemente del estado fisiológico de la célula la PLC-ζ se localizó en todo el flagelo (F).

Al evaluar el patrón de actina en los diferentes estados fisiológicos del espermatozoide, se encontró que en los EF la proteína se localizó principalmente en la región Sa (64%) y en F (12.2%), en FC fue 73% Sa y 8.8% Pa, mientras que en FRA 76% Sa y 6.7% Ac. Por otra parte, en los ED se identificó 46% en toda la cabeza del espermatozoide (C) en combinación con F, en cuanto a DC fue 62% Pa y 23% C, finalmente en DRA fue 52% en F (con una marca tenue en el ecuador) y un 44% solamente en F.

Así, en este trabajo encontramos que la PLC-ζ se localizó en la región subacrosomal de la TP de todas las muestras estudiadas (espermatozoides frescos y descongelados), sin embargo, el menor porcentaje fue para los espermatozoides frescos (39.4%). Lo cual difiere con los datos publicados por otros autores (16). Al igual que Young et al. (17) encontramos que esta proteína se localiza en región acrosomal, pero solamente en los EF y FC, siendo muy bajo su porcentaje en los espermatozoides descongelados (menor a 4%); coincidiendo con aquellos reportados por Kashir J.et al, 2013 (18) que mencionan que la PLC-ζ en espermatozoides capacitados se encuentra en la región acrosomal. En los espermatozoides con FRA encontramos que la proteína aparentemente es liberada de la región Ac, lo cual apoya lo mencionado por Mejía de que la proteína es liberada durante este proceso, sin embargo, este patrón lo presentaron mayormente los espermatozides descongelados no capacitados (24%). También encontramos a la proteína en la Pa, lo cual concuerda con Young et al. (17), pero en nuestro caso el porcentaje mayor fue para DRA.

Nuestros resultados de actina muestran que esta proteína se localizó principalmente en la Sa de la TP de todas las muestras estudiadas, con excepción de los espermatozoides DRA, sin embargo, el menor porcentaje fue para los ED y DC (menor al 4%), lo cual difiere con lo reportado con Naresh, (19) quien menciona que para EF actina se localiza principalmente en flagelo. Mejía FI. et al. (16) mencionan que el principal patrón para EF es en el ecuador, pero nosotros dicho patrón lo localizamos principalmente en espermatozoides FRA (52%). En cuanto a espermatozoides descongelados el principal patrón de localización fue en la región Pa (62%) seguidamente en la región ecuatorial y flagelo (52%), lo cual no concuerda con lo reportado con Brener et al., (20) quienes mencionan que conforme se da la capacitación in vitro en espermatozoides de toro, el patrón de localización de actina primero se da en la pieza media y más tarde en la cabeza del espermatozoide. Naresh (19) menciona que como resultado del proceso de crioconservación se ocasiona daño en el citoesqueleto de actina por lo que su patrón de localización cambia, nuestros resultados apoyan lo anterior mencionado, ya que de encontrarse en un inicio en la Sa en EF cambia a localizarse principalmente en el ecuador y flagelo en ED.

 

La criopreservación altera el patrón de localización de PLC- ζ y el de la actina, lo cual podría ser una de las principales razones por la cual hay una reducción de la calidad espermática y por consecuente un fracaso en la fertilidad de los espermatozoides criopreservados. Estudios están siendo realizados para evaluar como afecta esta alteración la fisiología espermática.