Efecto de los criopreservadores de semen congelado bovino en la extracción de DNA

La ganadería bovina es una de las principales áreas productivas pecuarias en el país (FIRA 2017). Las estrategias de conservación, mejoramiento y producción a pequeña gran escala conllevan a manejo adecuado del germoplasma que asegure las características de las razas de interés económico y cultural; destaca el procesamiento de semen en el mantenimiento de estas características para su explotación y conservación de diversidad, que incluyen la evaluación morfofisiologica de los espermatozoides y la calidad sanitaria. En el aspecto sanitario las pruebas disponibles se fundamentan en métodos inmunológicos o en el aislamiento de microrganismos, que en algunos casos son exigentes nutrimentalmente. Por lo anterior el aprovechamiento de pruebas genéticas es fundamental para el desarrollo de estrategias con mayor especificidad y sensibilidad en la detección de agentes patógenos que pueden ser transmitidos por este tipo de material biológico. La obtención de material genético con calidad óptima para el desarrollo y aplicación de variantes de técnicas de PCR es fundamental, debido a que sin esto se disminuye la posibilidad de determinar su estado sanitario para implementar estrategias de conservación. Este estudio evaluó el efecto de tres criopreservadores de semen en el proceso de extracción de DNA (método tradicional de fenol-cloroformo con proteinasa K y el método comercial de TRIzol) y en la amplificación mediante PCR de un fragmento del gen 16S para determinar el mejor criopreservador de semen para muestras en las que se determinaran los patógenos de importancia.

El estudio fue realizado en el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, ubicado en el municipio de Tepatitlán de Morelos del estado de Jalisco.

Se tomaron 15 eyaculados bovinos criopreservados en diluyentes basados en lecitina, yema de huevo y leche, así como muestras sin diluyente. Parao obtener las muestras se limpió con un antiséptico la zona del prepucio de los animales y se colectó el semen de cada uno en tubos estériles de 50 ml, los animales se estimularon vía un electro eyaculador (EE) automático. Cada muestra de semen se evaluó macroscópicamente (volumen y color) y microscópicamente (motilidad total y progresiva, vitalidad y concentración).

Las muestras de semen se procesaron con fines de criopreservación en lecitina de soya, leche y yema de huevo y muestras sin ningún aditivo (control). En las muestras con diluyente la concentración de espermatozoides se ajustó a 20 millones, las pajillas se sellaron y se les aplicó un enfriamiento lento, primero a 3 oC por 4 horas, posteriormente se trasfirieron a vapores de nitrógeno líquido por  30 min, y finalmente se colocaron en tanques con nitrógeno líquido a -196 oC.  Para cada uno de los métodos de extracción se procesaron 12 pajillas (3 por tratamiento y 3 de control) de cada uno de los 15 eyaculados. El método tradicional de fenol- cloroformo con proteinasa K modificado de Wilson (1990), se incrementó la cantidad de SDS y proteinasa K para la lisis celular y se utilizaron 2 pajillas con un volumen de 200 µl cada uno. En el sistema comercial TRIzol se  usó el volumen de 3 pajillas con 750 µl. Del reactivo; se siguieron los pasos de purificación y rehidratación en agua para cada método el volumen final fue de 50 µl y se almacenó a -20 0C hasta su uso. Se evaluó la concentración y pureza del DNA en un NanoDrop2000 (Thermo scientific), y su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se hizo una comparación entre la concentración e integridad del DNA obtenido de las muestras y se confirmó su utilidad para PCR punto final con la amplificación de una secuencia parcial de ~500 pares de bases del 16S rDNA utilizando los iniciadores universales 5B forward 5’-TTG GAGAGTTTTGATCMTGG-3’ y 3A reverse 3’-GTATTACCGCGGCTGCTG-5’, con esta prueba también se evaluó la presencia de inhibidores de PCR.

Del lote de muestras criopreservadas (200 µl por pajilla) se logró la extracción de DNA por ambos métodos. Las muestras presentaron integridad suficiente para su uso en pruebas de PCR punto final o qPCR (Cuadro 1). Con el método de fenol- cloroformo se obtuvieron los mejores resultados evaluados (Funcionalidad para PCR, concentración, pureza e integridad) los mejores porcentajes a excepción de integridad; donde TRIzol obtuvo un 100%.

Cuadro 1.- Comparación de métodos de extracción según el criterio de calidad

 

El uso de dos pajillas (200 µl cada una) por diluyente para cada método de extracción mostro buenos resultados en los criterios a evaluar de la investigación de igual forma Ruíz et.al. (2010) mencionan que la cantidad de muestra a utilizar en un protocolo de fenol-cloroformo debe ser de 0.25 a 0.5 ml. del contenido de la pajilla, es decir una o dos pajillas de semen congelado de 1/4 ml. ya que con una mayor cantidad de muestra obtuvo resultados negativos (Figura 1).

Existe nula información sobre el uso de los crioprotectores empleados; sin embargo, los resultados indican que con el diluyente con Lecitina se obtuvieron los mejores porcentajes en pureza y concentración (Cuadro 2). Se tomó como criterio de calidad una concentración de 10-20 ng/µl de DNA en PCR; y en pureza de 1.8-2.0  ng/µl.

Los diluyentes que cumplen con las características evaluadas fueron lecitina o yema de huevo; mientras que en el mercado a nivel nacional se utiliza leche con mayor frecuencia. El fenol-cloroformo es la técnica recomendada para extracción de DNA con semen congelado (Figura 4)

De los tres criopreservadores de semen evaluados para la extracción de DNA y la amplificación mediante PCR de un fragmento del gen 16S se determinó que la lecitina fue el mejor criopreservador de semen para muestras en las que se determinaran los patógenos de importancia. Además, el método de fenol- cloroformo obtuvo los mejores resultados de concentración, pureza, integridad y funcionalidad de amplificación a partir de DNA extraído de semen bovino congelado.