Embriones bovinos

Introducción

Desde los primeros trabajos de transferencia embrionaria realizados por Rowson y Col en 1976 (3), la estimulación ovárica o superovulación sigue siendo un tema de real preocupación ya que los resultados no siempre son favorables, y a veces son negativos.

En la industria de la transferencia embrionaria, a pesar de los progresos en cada paso de la metodología en la producción de embriones y en su transferencia, la principal desventaja es la imposibilidad de asegurar que una donante potencial pueda proveer un apropiado número de embriones de calidad en un tiempo establecido.

El componente más importante en este problema es la gran variabilidad entre individuos en su respuesta ovulatoria a los tratamientos. Las variaciones individuales pueden ser atribuidas fundamentalmente a la elección de los tratamientos superovulatorios aplicados a los animales, y en las diferentes respuestas de los mismos a un tratamiento dado. (1, 2, 3, 4, 5, 7).

Una alta cantidad y calidad de embriones en un régimen de superovulación podrían ser obtenidas por dos métodos.

1. Producir más ovulaciones sin reducir el rango normal de fertilización, y el progreso del desarrollo temprano de los óvulos fecundados.

2. Incrementar el rango de desarrollo de los embriones viables relacionados al mismo número de ovulaciones.

La primera condición se obtiene reclutando más complejos folículos-oocitos de alta competencia y que ellos ovulen sincrónicamente, y la segunda sería la de proveer un medio ambiente optimo para una normal fertilización y desarrollo embrionario.

Para que estas condiciones se den en el transcurso de la superestimulación debemos tener en cuenta una cantidad de factores ya sean intrínsecos o extrínsecos que pasaremos a detallar como causas básicas que afectan la superovulación:

a) endógenas: edad (8), raza, intervalo parto-inicio del tratamiento, estado endócrino de la donante al inicio del tratamiento, capacidad ovogénica (capacidad altamente heredable), estado del ciclo sexual al inicio del tratamiento, concentración progesterónica al inicio del tratamiento, receptividad del cuerpo lúteo a la acción luteolítica de las prostaglandinas, lactancia, paridad, estado metabólico;

b) exógenas: época del año, drogas usadas = FSH (relación FSH/LH), PMSG (relación FSH/LH-concentración de ácido siálico molecular) (7) (9) (11), uso de anti-PMSG Policlonal o Monoclonal (6), horario de aplicación de las drogas, calidad del producto y dosis de PGF 2 alfa.

Es muy importante tener en cuenta que muchas veces no podemos separar las causas, las cuales algunas de ellas van encadenadas; están tan relacionadas unas a otras que las tendremos que integrar en el mismo grupo, por ejemplo, sincronización foliculogénesis-ovogénesis-concentración progesterónica al inicio del tratamiento, exposición de los folículos a la LH subsiguiente a la superestimulación, y receptividad del cuerpo lúteo a las prostaglandinas.

Un destacado aspecto de los tratamientos de superestimulación folicular que necesitamos comprender es la variabilidad entre los animales tratados en cuanto al número de folículos que son estimulados para desarrollar y la cantidad de ellos que ovulan.

Un factor que contribuye a la variabilidad en la respuesta folicular a la superovulación que debe ser tomado en cuanta es el estado de la onda folicular ovárica en el momento del inicio del tratamiento gonadotrófico. Específicamente, la presencia de un folículo dominante al inicio del tratamiento aparentemente suprimiría la respuesta folicular a la superestimulación.

Otra característica en los protocolos convencionales de superestimulación es que solo una proporción de folículos estimulados a crecer progresan a la ovulación. Esto se debe a que en el momento del pico preovulatorio de LH algunos folículos que son estimulados para crecer no han llegado al estado de desarrollo total para responder a la LH y experimentar ovulación. Esto es probable que se exacerbe por una relativa ocurrencia temprana del pico u oleada de LH en las vacas o vaquillonas sometidas a los protocolos normales de Superestimulación del desarrollo folicular ovárico.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar si existen diferencias en la cantidad y calidad de embriones implantables cuando además de eliminar la presencia del folículo dominante retrasamos el pico preovulatorio de LH.

Materiales y métodos

Se utilizaron como donantes vacas de 3 a 10 años de edad, producción promedio 10500 kilos de grasa corregida al 3,5%, con un promedio de 125 días de lactancia, todas con historia de buena fertilidad, y vaquillonas de 15 a 22 meses de edad, sin patologías ováricas, todas hijas de madres fértiles. El trabajo se llevó a cabo en tres establecimientos de la Provincia de Buenos Aires, se descartaron las vacas repetidoras o con patologías ováricas, a todas se les realizó un perfil metabólico mineral y hepático y se les suministró la misma dieta.

Se implementaron tres tipos de tratamiento de superovulación que hemos llamado SUP 1, SUP 2 y SUP 3. En SUP 1 fueron tratadas 20 vacas; SUP 2: 15 vacas, 8 vaquillonas inseminadas con semen convencional y 5 vaquillonas con semen sexado, y SUP 3: 14 vacas, 5 vaquillonas inseminadas con semen convencional y tres vaquillonas inseminadas con semen sexado.

SUP 1

Respuesta a la superovulacion y calidad de los embriones en bovinos lecheros de elevado merito genetico, Uso de diferentes protocolos - Image 1

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SUP 1 representa un protocolo típico de superovulación que involucra la aplicación de un CIDR impregnado con 1,9 g de Progesterona, en forma conjunta con 5 mg de 17 β estradiol Burnet siete días antes del comienzo del tratamiento. A partir del día cero, dos inyecciones diarias de FSH (Foltropin) durante 4 días, en dosis diarias repartidas cada 12 horas, decrecientes de 80-60-40-20 mg, por animal. La primera dosis de prostaglandina F2α a las 48 horas del día cero. El retiro del dispositivo a las 60 horas de iniciado el tratamiento, junto a la 2da dosis de PG. En este esquema el pico de LH se observa entre las 90 y 96 horas del inicio del tratamiento y la ovulación comienza entre las 110 a 130 horas de iniciada la FSH

SUP2

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SUP2 es una modificación del protocolo anterior. Se utilizo un CIDR impregnado con 1,9 g de progesterona entre el día 5 y 7 después del celo. El mismo día del implante se inyectaron 110 mg (5 ml) de progesterona oleosa (Progeron Burnet) por vía intramuscular. La inyección de Estradiol 17 β (Burnet) se realizo a las 36 horas posteriores a la inserción del implante vaginal, iniciando la FSH a las 108 horas posteriores a la aplicación del estrógeno natural. La Prostaglandina se suministra a las 72 horas de iniciada la superovulación (SO) y se retira el implante en la última inyección de FSH (84 horas del inicio de la SO). En este protocolo el pico de LH se observa entre las 118 a 120 horas del inicio del tratamiento y la ovulación comienza entre 134 a 140 horas de aplicar la FSH.

SUP 3

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SUP 3 en este protocolo se utiliza un agonista de GnRH, 2,1 mg de acetato de Deslorelin por implante vía SC, liberando aproximadamente 20 mg de droga cada 24 horas. Este previene la liberación endógena de LH durante el tiempo que esté actuando. Se repite el mismo protocolo que SUP 2 en cuanto al uso del CIDR y del estradiol. La inyección de LH (25 mg de Lutropin) se realiza a las 108 horas de iniciado el tratamiento (48 horas de retirado el dispositivo vaginal) con la primera dosis de IA. Se repiten dos dosis más de IA con intervalos de 12 horas.

La totalidad de las vacas fueron inseminadas con el mismo semen, en pajuelas de 0,5 ml, concentración espermática /pajuela ± 25 X 10⁶. El régimen de Inseminación en SUP 1 y SUP 2 fue de 4 dosis con la siguiente secuencia: 1 dosis la primera IA, 2 dosis la segunda IA junto a 25 mg de Lutropin (LH) y 1 dosis la tercera IA. En SUP 3 la aplicación de LH se realiza en la primera IA a las 48 de retirado el implante. Todas las vacas fueron inyectadas con 100 mg de progesterona en vehículo oleoso (Progeron Burnet) al 3º día de la última IA.

En vaquillonas, la droga usada fue Pluset (LH - FSH) 500 UI. El semen utilizado tanto convencional como sexado fue del mismo toro y de la misma partida, en pajuelas de 0,25 ml., concentración espermática 20x10⁶en el convencional y 3x10⁶ en el sexado. Régimen de inseminación en semen convencional y SUP 2, 2 dosis en la primera Inseminación junto con 25 mg de LH (Lutropin). En SUP 3, la inyección de LH se realiza junto con la primera IA a las 48 de retirado el implante. Con semen sexado, 4 dosis con la siguiente secuencia; 2 dosis en la primera IA junto con 25 mg de LH y 2 dosis entre 10 a 12 horas después. La eficacia de este tratamiento está basada en lograr el depósito del semen a nivel de la mitad de cada cuerno uterino. Todas las inseminaciones se realizaron con protector vaginal de vaina. Todas las vaquillonas se inyectaron con 110 mg de Progesterona (Progeron Burnet) al 3º día de la última IA.

Para evaluar la respuesta superovulatoria en los distintos tratamientos se realizo ultrasonografía ovárica con transductor lineal transrectal de 8 Mhz, 7 días posteriores a la IA, y se contabilizó el número y diámetro de los cuerpos lúteos.

La evaluación estadística se realizó a través de análisis de varianza (ANOVA) y Test de Rangos Múltiples, programa Statgraphics plus versión 5.1.

Resultados y discusión

Tabla 1.- Recolección de óvulos y embriones según los protocolos utilizados en VACAS Inseminadas con semen convencional (media ± Error Estándar)
	Total vacas	Cuerpos luteos	Estructuras totales	Fertilizados degenerados no implantables	No Fertilizados	Implantables
SUP 1	20	12,35 ± 1,79	9,10 ± 0,59	3,15 ± 0,58	1,65 ± 0,37	4,31 ± 0,78
SUP 2	15	14 ± 1,36	12,33 ± 1,36	2,86 ± 1,36	3,06 ± 0,86	6,40 ± 0,60
SUP 3	14	11 ± 0,83	9,93 ± 0,83	1,46 ± 0,36	1,92 ± 0,72	6,64 ± 0,72

Tabla 2.- Recolección de óvulos y embriones según los protocolos utilizados en VAQUILLONAS Uso de semen convencional y Sexado (media ± Error Estándar)
	Tipo de semen	Total vaq.	Cuerpos luteos	Estructuras totales	Fertilizados degenerados no implantables	No Fertilizados	Implantables
	Convencional	10	12,9 ±1,66	10,1 ± 1,52	2,5 ± 0,77	3,00 ± 0,73	5 ± 1,08
SUP 2	sexado	9	9,6 ± 0,92	8,4 ± 0,67	2,2 ± 0,58	3,2 ± 1,00	3 ± 1,00
	Convencional	5	14,77 ± 2,08	12,77 ± 2,04	1,7 ± 0,49	4,00 ± 1,51	7,00 ± 1,48
SUP 3	sexado	6	15,83 ± 2,02	12,83 ± 1,22	1,66 ± 0,42	4,50 ± 0,76	6,66 ± 0,76

En la tabla 1 observamos que tenemos más cuerpos lúteos y estructuras totales en SUP 2 y SUP 3 aunque estas diferencias no son significativas, en cambio, sí aparecen estas diferencias significativas con un valor > 95 % de SUP 2 y SUP 3 con respecto a SUP 1 al considerar los embriones implantables, los que se obtienen en mayor porcentaje en los protocolos SUP 2 y SUP 3, lo cual demuestra la importancia de retrasar el pico de LH para lograr una mayor cantidad de ovocitos totalmente capacitados, que potencialmente nos darán mayor número de embriones viables.

En la tabla 2 se observa que se incorpora una nueva variable, el semen sexado a los protocolos SUP 2 y SUP 3, acá también observamos diferencias que nos muestran menor número de embriones implantados al trabajar con semen sexado.

Conclusión

En los protocolos de superovulación donde se retrasa el pico de LH con respecto al final del tratamiento con FSH, se obtiene un mayor porcentaje de embriones implantables.

Bibliografía

1.- Moor RM, Kruip Tham, Green D. Intraovarian control of folliculogenesis: limits to superovulation? Theriogenology 1984; 21:103-116.

2. - Monniaux D, Chupin D, Saumande J. Superovulatory responses of cattle. Theriogenology 1983; 19:55-81.

3. - Hasler J.F., McCauley A.D., Schermerhorn E.C., Foote R.H. Superovulatory responses of Holstein cows, Theriogenology 19 (1983) 83-99.

4. - Saumande J, Procurer R, Chupin D. Effect of injection time of anti-PMSG serum on ovulation rate and quality of embryos in superovulated cows. Theriogenology 1984; 21: 727-731.

5.- Dhondt D, Bouters R, Spincemaille J, Coryn M, Vandeplassche M. The control of superovulation in the bovine with a PMSG antiserum. Theriogenology 1978; 9: 529-534.

6. - Goulding D., Williams D.H., Roche J.F., Boland M.P., Factors affecting superovulation in heifers treated with PMSG, Theriogenology 45 (1996). 765-773.

7.- Lerner S.P., Thayne W.V., Baker R.D., Hensche T., Meredith S., Inskeep E.K., Dailey R.A., Lewis P.E., Butcher R.L., Age, dose of FSH and other factors affecting superovulation in Holstein cows, J. Anim. Sci. 63 (1986) 176-183.

8. - Dieleman S.J., Bevers M.M., Vos P.L.A.M., and de Loos F.A.M., PMSG/anti-PMSG in cattle: A simple and efficient superovulatory treatment, Theriogenology 39 (1993) 25-42.

9. - Bo G.A., Adams G.P., Pierson R.A., Mapletoft R.J., Exogenous control of follicular wave emergent in cattle, Theriogenology 43 (1995) 31-40

10. - Bungartz L., Niemann H., Assessment of the presence of a dominant follicle and selection of dairy cows suitable for superovulation by a single ultrasound examination, J. Reprod. Fértil. 101 (1994) 583-591.

11.- De Luca L, García Pinto G. Uso de Anti PMSG Monoclonal en la superovulacion de vacas holstein de elevado mérito genético, Cabaña Stella Maris. Maldonado Uuguay. Revista Veterinaria Uruguaya. 1984. 33-39.

Drogas Usadas

Progesterona en Aceite Progeron de Laboratorio BURNET SA

Estradiol 17 β Laboratorio BURNET SA

Prostaglandina. Biggland Laboratorio BURNET

Implante Vaginal. EAZI-BREED y CIDR marcas registradas de InterAg, Hamilton, Nueva Zelanda

Agonista GnRH. Ovuplan Deslorelin Acetato 2.1 mg.

FOLLTROPIN (Veterpharm In. Canada): FSH purificada a la que se le ha extra ído un 80% de la LH. El envase contiene 450mg. NIH -FSH-P y 20 ml. de disolvente. (Hoy Laboratorio Bioniche)

- PLUSET (Calier, España): Relación 1:1 entre FSH/LH. El envase contiene 2 frascos con 500 u.i. de FSH y LH cada uno, y 20 ml. de disolvente