Identificación de puntos críticos de control en el manejo del calostro bovino en establos

La diarrea es la enfermedad más importante en  becerras  menores  a  30  días  de  edad (McGuirk, 2008). Existen varias causas de diarreas en becerros destacando las causadas por Escherichia coli (Sumano, 1996); sin embargo, lamayoría de los problemas de diarrea en los hatos son   causados   por   infecciones   mixtas   y   la inmunidad brindada por el calostro es una parte crítica del manejo de enfermedades entéricas en las becerras (McGuirk, 2008). Asegurar la ingestión de calostro  de  calidad  inmunológica  durante  la primera hora después del nacimiento es un punto crítico para la salud de las becerras (Rodríguez et al., 2013). Sin embargo, la calidad del calostro no sólo depende de su contenido de inmunoglobulinas, si  no  de  su  calidad  sanitaria  expresada  en  la cantidad de contaminación microbiana. El calostro al salir de la ubre contiene una baja cantidad de bacterias, pero las actividades relacionadas con su colecta, manejo, y almacenamiento incrementan el riesgo de su contaminación por bacterias (Fecteau et al., 2002). La pasteurización del calostro es una tecnología que permite disminuir la cantidad de bacterias presentes en éste, sin embargo, ésta no elimina el 100% de las bacterias (Elizondo-Salazar et al., 2010). En estudios previos para identificar puntos  críticos  de  control  para  contaminación bacteriana del calostro, se determinó que la mayor contaminación  bacteriana  ocurre  en  la  jarra  de colección del calostro durante el periodo de colecta y  durante  su  almacenamiento  a  temperatura ambiente (Stewart et al., 2005). Sin embargo, en dicho   estudio   sólo   se   tomaron   muestras directamente de la ubre, de la jarra colectora y del tubo  de  alimentación  esofágico;  siendo  que  el proceso  de  manejo  del  calostro  es  mucho  más complejo   y   consta   de   diversos   grupos   de actividades (Rodríguez et al., 2013). En general, el monitoreo bacteriológico de la calidad de la leche y el calostro realiza mediante el conteo estándar en placa, dicho análisis bacteriológico permite medir la  densidad  de  bacterias  presentes  tanto  gram-positivas como gram-negativas, lo que sirve como indicativo de malas prácticas en el ordeño, equipo sucio,  leche  proveniente  de  vacas  con  mastitis subclínica  o  clínica,  así  como  ubres  sucias (Cicconi-Hogan  et  al.,  2013).  Sin  embargo, bacterias coliformes como E. coli y Salmonella son las que tienen un mayor impacto negativo para la salud de las becerras (McGuirk, 2008). Por lo anterior, los objetivos del presente estudio fueron caracterizar actividades realizadas durante el manejo del calostro bovino, así como las enterobacterias presentes durante diferentes etapas de su manejo para poder determinar los mejores puntos críticos de control y generar una guía de muestreos bacteriológicos para realizar un monitoreo eficiente de la calidad bacteriana del calostro en establos.

 

El estudio se realizó en un establo del sistema intensivo de producción de leche de la Región Lagunera de Coahuila, México, en el municipio de Francisco I. Madero; éste se encuentra localizado en la región semidesértica del norte de México a una altura sobre el nivel del mar de 1,100 metros, entre los paralelos 26° 17’ y 26° 38’ de latitud norte; los meridianos 103° 18’ y 103° 10’ de longitud oeste (INEGI, 2009).

En dicho establo, todo el calostro se pasteuriza empleando un pasteurizador por lote (Dairy Tech Inc., Windsor, CO) a una temperatura de 60±5 °C por 60 minutos. El manejo del calostro se dividió en 4 grandes actividades o grupos de tareas: 1) Colecta; 2) Pasteurización; 3) Almacenamiento; y 4) Alimentación; y todas las tareas realizadas fueron registradas.

Fase 1. Se realizaron 2 muestreos en dos díasdiferentes donde en total se colectaron 24 muestras de calostro e hisopos de las superficies (inertes y vivas) que tuvieron contacto con el calostro: calostro tomado directamente de la ubre, de la jarra de colección de calostro, de los guantes del ordeñador, calostro antes y después de pasteurizar, de la tina del pasteurizador y su válvula de salida, de las bolsas para almacenar calostro de pasteurizar, así como de la mamila y el chupón que se emplearon para administrar calostro a una becerra.

Fase 2. Se realizaron 3 muestreos en tres díasdiferentes donde en total se colectaron tres muestras de calostro antes de pasteurizar, tres 

muestras de calostro inmediatamente después de la pasteurización, tres muestras de calostro descongelado en un baño maría previo a ser colocado en la mamila y quince muestras de diversas superficies que tienen contacto con el calostro después de su pasteurización.

El análisis microbiológico de calostro y de superficies vivas e inertes, consistió en el recuento bacteriano de unidades formadoras de colonias (UFC) de coliformes totales (CT) y coliformes fecales (CF) con base en las NOM-031-SSA1-1993 y NOM-036-SSA1-1993. Se tomó 1 ml de calostro o del tubo con la muestra (en el caso de superficies vivas e inertes) para realizar diluciones seriadas en tubos con 9 ml de solución salina al 1x10^-1, 1x10^-2 y 1x10^-3, posteriormente se tomó 1 ml de muestra de las diluciones seriadas y se depositó en cajas Petri, vertiéndole a las cajas con muestras el medio de cultivo de agar rojo bilis violeta, se incubó a 35 °C por 24 ± 2 h y 42 °C por 48 ± 2 h para CT y CF, respectivamente (Isidro et al., 2018). El aislamiento y la identificación de Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., Shigella spp. y otrasenterobacterias se realizó con base en la NOM-210-SSA1-2014. Con un asa bacteriológica calibrada, se tomó una alícuota y se sembraron en cajas Petri con medios de cultivo MacConkey y Salmonella-Shigella, incubándose a 35 °C por 24 ± 2 h, posteriormente, se evaluaron las cajas para observar el crecimiento de colonias. Una vez identificadas, se tomó la colonia más aislada y con un asa bacteriológica de punta se sembró en los medios de cultivo Agar Triple Azúcar de Hierro, Citrato de Simmons, Agar de Hierro y Lisina y Movilidad Indol Ornitina, incubándose a 35 °C por 24 ± 2 h. Transcurrido el tiempo, se leyeron los resultados de los diferentes tubos. Para determinar el límite de microorganismos (Tabla 1) y considerar una tarea como punto crítico de control se emplearon los criterios mencionados por McGuirk (2008), el laboratorio de diagnóstico veterinario de la Universidad de Wisconsin en Madison (2015) y la NOM-093-SSA1-194.

Para el análisis estadístico se empleó el programa estadístico R versión 3.6.1 (R Core Team, 2019). Los resultados de conteos en placas no se distribuyen normalmente, por lo que fueron transformados a Log10. Para la fase 1, se realizaron análisis estadísticos descriptivos (media, desviación estándar, rango y frecuencia). Para la fase 2, los resultados de conteos en placas se analizaron mediante estadística descriptiva y análisis de varianza para un diseño completamente al azar.

En la Tabla 2 se presentan las actividades realizadas durante el manejo del calostro bovino desde su colecta hasta su administración.

Cabe mencionar que dentro de los protocolos del establo se encuentra la toma de muestras de calostro antes y después de su pasteurización para su análisis por medio de conteo estándar en placa. Los resultados de dichos análisis nos fueron facilitados durante el periodo del estudio y en ninguna ocasión rebasaron los límites críticos (3.5±0.30 UFC Log10 ml^-1).

Tabla 2. Descripción de las tareas realizadasdurante el manejo del calostro.

La colecta del calostro fue realizada por el encargado de pasteurización en una sala tipo espina de pescado siguiendo la siguiente rutina de ordeño: pre-sello, despunte, secado, colocación de pezoneras, ordeño, retiro de pezoneras manual y aplicación de sello. En todo momento el empleado usó guantes de nitrilo. El calostro fue colectado en jarras específicas para dicho objetivo. Posterior a la colecta, el calostro de las jarras colectoras fue filtrado con una malla de plástico colocada entre 2 coladeras metálicas de tipo “cocina” y vaciado a una bolsa plástica blanca dentro de un recipiente de 20 litros. Inmediatamente se colocó dentro de la bolsa una botella de 2 litros con agua congelada. La botella fue previamente lavada, desinfectada con iodo y secada con papel de estraza. El calostro fue transportado a la sala de pasteurización y se mantuvo en la bolsa cerrada mientras se preparaba el equipo de pasteurización.

El pasteurizador de calostro era lavado con jabón clorado, enjuagado con agua y desinfectado con iodo todos los días después de la pasteurización. Al día siguiente, al momento de llegar con el calostro recién ordeñado, el encargado de la pasteurización enjuagaba con agua corriente el pasteurizador. Posteriormente, vaciaba la totalidad del calostro colectado en la tina del pasteurizador y lo encendía. La pasteurización se realizó a una temperatura de 60 °C por 60 minutos, en 4 fases: 1) encendido; 2) elevación de la temperatura a 60 °C; 3) pasteurización (60 minutos a 60±0.5 °C); y 4) enfriamiento a 39 °C.

Una vez que el equipo pasteurizador se apagaba, se midió la calidad del calostro recién pasteurizado directamente en la tina del pasteurizador empleando un refractómetro Brix digital tipo pluma con compensación automática de temperatura (Pen-Harvest, escala 0 a 33 % Brix; ATAGO U.S.A., Inc.). Posteriormente, el encargado se colocaba guantes de nitrilo y abría la válvula de paso del pasteurizador y para llenar una jarra de plástico graduada de 2 litros con calostro. El calostro de la jarra era vaciado en una bolsa tamaño grande con cierre hermético (Ziploc, México) con capacidad de 2 litros. Cada bolsa fue identificada con la fecha y la calidad de calostro, se le sacó la mayor parte de aire y se cerró perfectamente. Cada bolsa fue colocada horizontalmente dentro de un congelador de tipo cofre. Todos los días se colocaban de 4 a 6 bolsas de calostro previamente congelado en el refrigerador vertical (4 °C) para comenzar con su descongelación, y si posterior a 24 h de que el calostro fuera colocado en el refrigerador, éste no era usado, se tiraba.

Al momento de que una becerra llegaba al área de crianza después del nacimiento, el encargado de la pasteurización tomaba 2 bolsas de calostro previamente descongeladas en el refrigerador o si no había calostro descongelado tomaba bolsas congeladas. Las bolsas eran colocadas dentro de un baño María (GEMEX, Torreón) a una temperatura de 55 °C durante 30 a 40 min. Cada 20 a 15 minutos se tomaba la temperatura del calostro sin abrir la bolsa, colocando un termómetro digital pegado a la parte externa de ésta. Si la temperatura registrada era de 40 °C la bolsa de calostro se secaba y se colocaba encima de la tapa del congelador, si la segunda bolsa también había alcanzado la temperatura se sacaba del baño María y colocaba en una cubeta con agua a 52 °C. El encargado de la alimentación con calostro tomaba un biberón (capacidad = 2 litros) y un chupón que fueron previamente lavados y desinfectados, los enjuagaba con agua corriente y vaciaba el contenido de la primera bolsa de calostro al biberón, colocaba el chupón y se dirigía con la mamila y la cubeta con la segunda bolsa de calostro a alimentar a la becerra.

Las características de las 24 muestras, así como medias de los conteos de CT, CF y tipo de bacterias identificadas se presentan en la Tabla 3. En el 62.5% (15/24) de las muestras hubo crecimiento de CT y CF. Sin embargo, sólo en el 25% (6/24) de las muestras los conteos de CT fueron mayores al límite y en el 37.5% (9/24) los conteos de CF fueron mayores al límite crítico.

En las Tablas 4 y 5, se muestran las medias de los conteos de CT y CF de todas las muestras y de las muestras en que hubo crecimiento bacteriano, respectivamente.

 

 

En el 29.2% (7/24) de las muestras se identificaron coliformes fecales, el 71% (5/7) de estas muestras correspondieron a la actividad de colecta y el 29% (2/7) a la actividad de alimentación. Nuestros hallazgos concuerdan con lo reportado por Stewart et al. (2005) donde encontraron que los conteos de bacterias eran generalmente bajos en muestras colectadas directamente de la ubre (menores a 4 y 3 UFC Log10 ml-1 , para CT y CF, respectivamente). Sin embargo, aunque en el presente estudio efectivamente encontramos CF en la muestra de la jarra colectora por encima del límite tal y como lo reportan los autores antes mencionados, es importante destacar que ellos encontraron valores mayores a 4 UFC Log₁₀ ml^-1, en comparación al 1.4 UFC Log₁₀ ml^-1 de nuestro estudio. Aun así, de acuerdo con nuestros resultados podemos sugerir que uno de los puntos críticos de control adicional a la adecuada desinfección de las jarras colectoras es la desinfección de los guantes. De manera general, en la literatura correspondiente a puntos críticos de control en el manejo del calostro bovino se reportan únicamente los conteos de CT sin llegar a la identificación de las especies por medio de pruebas bioquímicas (Fecteau et al., 2002; Stewart et al., 2005; McGuirk, 2008). Al respecto, en el presente estudio encontramos que las muestras tomadas de los guantes durante la colecta de calostro fueron las que rebasaron tanto los límites de CT como los de CF, así mismo fueron las muestras en las que identificamos bacterias patógenas como E. coli, Salmonella spp, Klebsiella spp, y Shigella spp. Con respecto a la actividad de pasteurización el punto crítico de control que sugerimos es la desinfección de la tina del pasteurizador, ya que en los dos días de muestreo tanto los CT como los de CF sobrepasaron los valores límite para superficies inertes. Si bien, nuestros resultados también nos permiten sugerir que la pasteurización del calostro fue efectiva ya que no se detectó crecimiento en las placas sembradas con las muestras de calostro recién pasteurizado. Por otro lado, para la actividad de almacenamiento, las muestras tomadas de los guantes del empleado durante el almacenamiento del calostro no presentaron crecimiento bacteriano lo que fue inesperado después de observar los resultados de las muestras de guantes de la actividad de colecta. Al respecto, es muy posible que esta divergencia en resultados sea debido a que durante la colecta se incrementan las posibilidades de que las manos de los empleados tengan contacto con heces de las vacas que están siendo ordeñadas, en cambio, el área donde se encuentra el equipo de pasteurización es generalmente limpia y no hay muchas probabilidades de contacto con heces. El punto crítico de almacenamiento de acuerdo con nuestros hallazgos es la desinfección adecuada de la jarra graduada de 2 litros donde se mide el calostro para llenar las bolsas ziploc. Finalmente, para la actividad de alimentación sugerimos como punto crítico de control, la desinfección adecuada de mamila en la que se ofrece el calostro a la becerra. Con respecto a la muestra de calostro pasteurizado que fue descongelado para alimentar a la becerra, el haber encontrado conteos por arriba del límite tanto para CT como CF nos permite sugerir como posible punto crítico de control el manejo del calostro durante su almacenamiento (enfriamiento – congelación). Al respecto, Stewart et al. (2005) en calostro sin pasteurizar refrigerado observaron que el conteo de CT se incrementó moderadamente durante las primeras 24 horas, posterior a estas 24 h, el incremento fue muy lento hasta las 96 horas de refrigeración. Finalmente, de muestras en las que se identificaron coliformes fecales en el 86% (6/7) sólo se identificó un solo tipo de bacteria (Providencia spp, E. coli o Proteus spp); sin embargo, Providencia spp fue la bacteria identificada con mayor frecuencia (71.4% de los casos). Al respecto existe poca evidencia de que las bacterias del género Providencia sean causantes de diarreas en becerras, por ejemplo, sólo se encontró una tesis en la que se cita a otros autores que indican que Providencia stuartii causa diarrea en becerros (Janda y Abbott, 1998 citados por Rogers, 2006). Adicionalmente, en la misma tesis (Rogers, 2006), se aislaron enterobacterias en heces de 100 vacas lecheras sanas en 5 establos de California y encontraron una prevalencia del 2% para Providencia rettgeri y P. stuartti en conjunto, la cual es muy baja. En general, las bacterias del género Providencia usualmente se consideran como flora normal del tracto digestivo, por lo que su detección como patógenos no se realiza de manera usual (Yoh et al., 2005); sin embargo, no debe descartarse este microrganismo como posible patógeno para las becerras ya que algunas especies de Providencia se han postulado como posibles causantes de diarrea en humanos, principalmente causando “diarrea del viajero” y en niños de países en desarrollo (Yoh et al., 2005).

En la fase 2, la pasteurización del calostro redujo efectivamente los CT y CF (P < 0.001) a menos del límite de CT y al límite de CF; sin embargo, no se detectaron diferencias para CT y CF entre calostro sin pasteurizar y calostro pasteurizadodescongelado (Tabla 6). Lo anterior, permite sugerir que se presentó crecimiento bacteriano en el periodo de almacenamiento del calostro después de su pasteurización, confirmando lo encontrado en la Fase 1 del presente trabajo. No se encontraron diferencias estadísticas (P > 0.05) entre grupos de superficies muestreadas para CT y CF. La cuenta de CT no rebasó el límite para ninguno de los grupos de superficies muestreadas; sin embargo, la cuenta de CF fue mayor al límite en los tres grupos de superficies muestreadas. Al respecto, una de las muestras de los guantes con los que se almacenó el calostro después de ser pasteurizado presentó conteos de 4.95 y 5.25 UFC Log₁₀ ml^-1, para CT y CF respectivamente. Así como una muestra del interior de la mamila con 3.35 y 3.15 UFC Log₁₀ ml^-1, para CT y CF respectivamente.

Del total de las muestras de la fase 2, en el 41.6% (10/24) se identificaron coliformes fecales, donde el 80% de los casos se identificó Klebsiella spp. Del total de muestras en las que se identificaron coliformes fecales, el 10% (1/10) fueron de calostro antes de ser pasteurizado, 20% (2/10) de calostro pasteurizado, el 60% (6/10) de calostro descongelado después de su pasteurización y 10% de superficies, específicamente los guantes del pasteurizador (4.95 y 5.25 UFC Log₁₀ ml^-1, para CT y CF respectivamente) y la mamila (3.35 y 3.15 UFC Log₁₀ ml^-1, para CT y CF respectivamente). En humanos, Klebsiella spp. es una enterobacteria comúnmente aislada en el tracto respiratorio inferior y el tracto urinario que generalmente causa enfermedad a pacientes hospitalizados o se presenta como una infección secundaria con una alta tasa de mortalidad (Puerta-García y MateosRodríguez, 2010). En establos, Klebsiella spp. ha sido aislada en de casos de mastitis, tanques de leche, en las ubres de las vacas (Langoni et al., 2015). Klebsiella spp es la segunda causa de mastitis causadas por bacterias gram-negativas sólo después de E. coli (Munoz et al., 2006). Lo anterior, permite sugerir que posiblemente el trabajador encargado de la pasteurización sea parte crítica en la contaminación del calostro después de su pasteurización, ya sea por el uso de guantes contaminados con estiércol o tierra.

Adicionalmente, bacterias como Klebsiella spp han demostrado la habilidad de crecer a temperaturas de refrigeración (4° C o menos) además de ser una bacteria que comúnmente es encontrada post-pasteurización en leche fluida (Martin et al., 2018) y también puede encontrarse en productos lácteos (Hervert et al., 2017), por lo que, es importante su control mediante medidas de adecuada desinfección.

Lo anterior es muy importante para el control de la salud de las becerras, ya que, aunque ha sido en casos aislados, Klebsiella spp ha sido reportada como causante de abomasitis en becerros de un día de edad (APHA, 2017) y ha sido aislada en casos de diarrea severa en becerros entre 2 y 16 días de edad (Fecteau el at., 1997). Adicionalmente, esta bacteria ha sido aislada en casos de enfermedad respiratoria y casos de neumonía intersticial en becerros (Aslan et al., 2002; Morrell et al., 2008).

En todos los casos, la pasteurización del calostro disminuyó los conteos bacterianos de CT y CF al límite o por debajo del punto crítico; sin embargo, el calostro pasteurizado-descongelado mostró conteos de CT y CF por arriba del punto crítico. Lo anterior permite sugerir incluir muestreos bacteriológicos no sólo de calostro antes y después de pasteurizar sino de superficies que tienen contacto con el calostro como los guantes de los empleados, la tina del equipo pasteurizador y las mamilas. Adicionalmente, es importante revisar los protocolos de desinfección de las manos de los empleados, aunque usen guantes, jarras colectoras, así como utensilios que tengan contacto con el calostro. Finalmente, es importante que cuando se evalúan las prácticas de manejo o se realizan auditorías del calostro en los establos se incluyan dentro de las pruebas solicitadas los conteos de coliformes totales y coliformes fecales, así como la identificación de enterobacterias para poder identificar mejor las áreas susceptibles de mejora, ya que los resultados de conteo estándar en placa no rebasan el punto crítico dificultando la mejora del manejo del calostro.

Los presentes resultados forman parte del proyecto de apoyo a la investigación 153203593 “Pasteurización del calostro y buenas prácticas de manejo del calostro bovino para mejorar la sanidad de becerras”. Agradecemos a “Lácteos Nuevo León” el permitirnos llevar a cabo las actividades de validación del proyecto antes mencionado además de todas las facilidades brindadas. La mención de cualquier marca o producto propietario en el presente trabajo no constituye una garantía o la aprobación del producto por el INIFAP; así mismo, no implica la aprobación de la exclusión de otros productos que también pudieran ser adecuados.