Modificaciones a la técnica de Microhistología vegetal

INTRODUCCIÓN

El consumo de nutrientes, como principal factor limitante⁵, aunado a la selectividad, la capacidad ingestiva y la experiencia previa en el consumo de forrajes diversos³ determina la capacidad productiva de los animales herbívoros. Por lo anterior, es necesario conocer la diversidad de especies consumidas para predecir el comportamiento productivo y además de controlar el aprovechamiento de los recursos vegetales para no caer en una sobre explotación¹ . Desde el primer tercio del siglo pasado^4,8, la microhistología vegetal es una herramienta para la identificación taxonómica, mediante la observación y cuantificación de los tejidos epidérmicos de especies consumidas por herbívoros domésticos y de vida libre^4,6. Además de que nos permite conocer una aproximación de la composición botánica de la ración, mediante el análisis de heces o extrusas esofágica y/o ruminal⁴ . La identificación se realiza mediante la comparación de fragmentos y dibujos de laminillas de referencia. Si consideramos que los dibujos no representan fielmente los fragmentos observados al microscopio⁷ es necesario hacer adecuaciones que permitan una identificación confiable. Se han propuesto modificaciones a esta técnica y continuamente se mejora para lograr que sea una herramienta sencilla y rápida que ayude al investigador del área. Por lo anterior, el presente documento propone algunos cambios innovadores en la técnica desarrollada por Catán² para mantenerla vigente como herramienta metodológica.

MATERIALES

Equipo

Molino Arthur H. Thomas modelo wiley.
Estufa Ríos Rocha modelo HS-62 a 60 ºC.
Platina de calentamiento.
Campana extractora.
Microscopio Carl Zeiss, modelo Axio Lab E re.
Cámara fotográfica digital.
Tamiz 100 mesh.
Portaobjetos.
Cubreobjetos.

Reactivos y muestra

Material vegetal (molida).
Alcohol (96%).
Hipoclorito de sodio (60%).
Grenetina sin sabor.
Glicerina.
Fenol.

MÉTODOS

La técnica fue montada e implementada en el Laboratorio de bromatología del Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM. Es necesario resaltar la importancia de la capacitación que recibirá el personal que efectuará el procesamiento de las muestras; esto con la finalidad de reducir la variabilidad en la calidad del producto^6,9.

Secado y molido

El proceso se basa en el propuesto por Castellardo⁴ ; la planta, completa o sólo unas partes, se seca en un horno Ríos Rocha modelo HS-62 a 60°C / 24 h. Se retira la muestra, las partes grandes se cortan con tije- ras para facilitar la molienda, la cual se realiza en un molino Arthur H. Thomas modelo Wiley. La muestra molida se criba con una malla de 1 mm.

Diafanización

Con base en lo expuesto por Stittmalter y Dizeo, 1973; citado por Castellardo⁴, este proceso se realiza de lasiguiente forma:

a) El material se hierve en un vaso de precipitado con 40 ml de alcohol al 96% / 20 min (este paso se realiza en una campana de extracción, para lo cual se utiliza una platina caliente a 400°C).

b) Después de hervir el material, se enjuaga en un tamiz de 100 mesh con agua corriente y se es- curre por 10 minutos.

c) Inmediatamente, el material es colocado en un vaso de precipitado y se le agrega 40 ml de hipo- clorito de sodio (60%), dejándolo reposar el tiempo suficiente para que se torne transparente, este paso es supervisado permanentemente.

d) Una vez aclarado el material, se enjuaga con agua corriente, hasta que los restos del reactivo sean eliminados.

Medio de montaje

El medio de montaje utilizado es gelatina glicerinada, propuesto por Johansen, 1940 y descrito por Catán² , para lo cual se emplean:

15 g de grenetina.
90 ml de agua tibia.
105 ml de glicerina.
1.5 g de fenol.

a) La grenetina sin sabor (15 g) se disuelve en 90 ml agua caliente (35°C).

b) Posteriormente se agrega la glicerina y el fenol.

c) Mientras la mezcla se encuentre caliente, se filtra a través del algodón colocado en un embudo.

Nota: Si el medio se enfría, antes de utilizarse debe ser puesto en baño maría a una temperatura de 35 oC a 37 ºC.

Montaje

El montaje se realiza esparciendo 6 mm³ del material molido sobre un portaobjetos, al que se le adiciona 2 ml del medio de montaje; se coloca un cubreobjetos de 22 x 22 mm dejándolo caer suavemente de un extre- mo a otro con la finalidad de eliminar las burbujas de la laminilla. Para asegurar una mejor conservación las laminillas se sellan utilizando esmalte transparente para uñas⁴ ; al finalizar el montaje, las preparaciones se identifican con una etiqueta.

Observación

La observación se lleva a cabo en un microscopio Carl Zeiss, modelo Axio Lab E re, equipado con una cámara fotográfica digital Sony Cyber-shot DSC-W230 de 12.1 Mega Pixeles con una lente Carl Zeiss Vario – Tessar 2,8 – 5.8/5,35 – 21,4. Las preparaciones son observadas con objetivos de 40X y 100X. El objetivo de 40X, se emplea con la finalidad de determinar la tasa de aparición de las especies. Las características epidér- micas, se observan con el ocular de 100x por campo, entiéndase campo como el área fija comprendida en una observación, descrito por Spark y Malechek (1968) citado por Catán² . La identificación de las especies se realiza mediante fotografías digitales tomadas a partir de las observaciones con 100 aumentos, para el cálculo de la tasa de aparición son empleadas fotografías tomadas de observaciones con 40 aumentos y/o a partir de 5 observaciones con 100 aumentos. Las fotografías de todos los patrones de la planta por campo, permiten un mejor estudio y facilitan la visualización de las características epidérmicas; además de obtener un respaldo.

RESULTADOS

A continuación se muestran las estructuras de especies vegetales de un bosque de encino. Para reportar las observaciones se realizó la toma de fotografías digitales; la observación se realizó con el objetivo de 100x, este nos permite tener mayor detalle sobre las características microhistológicas.

Modificaciones a la técnica de Microhistología vegetal - Image 1

La observación de estas estructuras nos permite realizar una identificación certera y precisa de las especies vegetales consumidas por los animales. Gracias a estas observaciones podemos conocer los patrones de se- lectividad que presentan los herbívoros. Cabe resaltar que las observaciones obtenidas son de igual calidad que las reportadas por Catán² y Castellardo¹ .

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Es importante seguir los pasos respetando los tiempos y cantidades a emplear; con la intención de reducir los factores que pueden llegar a modificar el resultado obtenido, provocando una lectura poco exacta y en ocasiones inútil para la lectura⁹ . El uso del hidrato de cloral al 5% como clarificador² , no fue necesario. También el uso de una solución acuosa (1:1) de alcohol al 96% e hidróxido de sodio al 5% por 10 min^2,4, para la diafanización, se cambio por el uso del alcohol al 96% durante 20 min. Las modificaciones disminu- yen el uso de sustancias controladas y difíciles de conseguir. Para el medio de montaje se empleó gelatina glicerinada, reemplazando la solución de Hoyer² , y se reducen de los tiempos de preparación. En el 2007, Castellardo reporta la toma de fotografías, con la intención de mantener un respaldo; además de realizar observaciones con objetivos de 200x y 400x; la propuesta generada en este documento muestra que con las observaciones a 100x (manipulando el zoom de la fotografía), se obtienen resultados claros y precisos.

Las modificaciones propuestas en el presente trabajo facilitan el procesamiento de la especies vegetales, disminuyendo los tiempos de la técnica; además de mejorar la identificación haciéndola exacta y leal al poder mostrar fielmente las características microhistológicas. La microhistología vegetal sigue siendo una herramienta de vanguardia que permite el estudio de las especies vegetales consumidas así como los hábi- tos de alimentación de herbívoros domésticos y de vida libre.

LITERATURA CITADA

Castellardo GG. Squella NF, Ullrich RT, León CF, Raggi SA. Algunas Técnicas Microhistológicas Utilizadas en la Determinación de la Composición Botánica de Dietas de Herbívoros. Agricultura Técnica (Chile) 2007, 67(1): 86-93.

Catán A, Degano CAM, Larcher L. Modificaciones a la Técnica Microhistológica de Peña Neira para Especies Forrajeras del Chaco Semiárido Argentino. Quebracho. Revista de Ciencias Forestales 2003, N°10. 71-75p.

Catán A, Degano CAM, Werenitzky D. Evaluación de Criterios de Lectura Microhistológica para la Cuan- tificación de Sphaeralcea bonariensis (Cav.), Pl Lorentz en Mezclas Manuales. Técnica Pecuaria México 2007, 45(1): 77-83.

García DE, Medina MG, Cova LJ, Torres A, Soca M, et al. Preferencia de Vacunos por el Follaje de 12 Espe- cies con Potencial para Sistemas Agrosilvopastoriles en el Estado de Trujillo, Venezuela. Pastos y Forrajes 2008, 31(3): 255-270.

Hardoy A. Danelo JL. Selección de la Dieta y Consumo de Rumiantes en Pastoreo. Nutrición Animal Apli- cada 1989, 2(8): 32-34.

Holechek JL, Gross B. Training Needed for Quantifying Simulated Diets from Fragmented Range Plants. Journal of Range Management 1982, 35 (5).

Johnson MK, Wolford H, Pearson HA. Microhistological Techniques for Food Habits Analyses. Research paper SO-1 99. USDA, Forest Service, Southern Forest Experiment Station 1983; New Orleans LA.

Toral POC, Iglesias GJM. Selectividad de Especies Arbóreas Potencialmente Útiles para Sistemas de Pro- ducción Ganaderos. Zootecnia Tropical 2008, 26(3): 197-200.

Vavra M, Holechek JL. Factors Influencing Microhistological Analysis of Herbivore Diets. Journal of Range Management 1980, 33(5): 371-374.

Modificaciones a la técnica de Microhistología vegetal

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