Superovulación de hembras criollas lechero tropical

INTRODUCCIÓN

Las diversas biotecnologías reproductivas se utilizan para la conservación, expansión y mejora genética de bovinos [3, 18, 47]. La ovulación múltiple y la transferencia de embriones (OMTE) permiten acortar el intervalo generacional y aprovechar el potencial genético de las hembras y de los sementales genéticamente superiores [18, 26].

En Latinoamérica existen razas criollas de ganado adaptadas a las condiciones ambientales locales, producto de la selección natural y la selección artificial [44]. El ganado criollo Lechero Tropical (LT) es un Bos taurus que desciende del ganado introducido al nuevo mundo en el siglo XV, adaptado a los climas cálidos tropicales [13, 37, 38]. El LT puede alimentarse en praderas de gramíneas tropicales y producir leche de alta calidad en lactancias de 305 d [40, 41]. La población de ganado LT en México es menor de 1000 animales [16] y la mayoría de los criadores de la raza no poseen hembras puras [2]. Para la mejora genética del LT, se utiliza como tecnología reproductiva la inseminación artificial (IA); sin embargo, no se ha utilizado la OMTE, por el desconocimiento de los protocolos reproductivos que hacen factible el uso de esta tecnología en la hembra LT.

La Hormona Folículo Estimulante (FSH) ha sido ampliamente utilizada para superovular hembras productoras de leche y de gran formato como la Holstein, con dosis de hasta 400 mg (Folltropin-V [23]; 1 mg de Folltropin-V es equivalente a 1 mg de NIH-FSH-P1 Bioniche Animal Health Inc., Belleville, Ontario, Canadá. Las hembras criollas son de formato pequeño y de un peso corporal adulto del orden de 450 kg [12] y se desconoce su respuesta fisiológica superovulatoria a la aplicación de diferentes dosis de FSH. Vacas Criollo Limonero de Venezuela fueron superovuladas utilizando 260 mg de Folltropin-V [19].

El uso de la OMTE permitirá aumentar el número de hembras puras LT de los criadores, incrementar la mejora genética de la población y establecer un banco de germoplasma. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue comparar el efecto de dos dosis de FSH en el comportamiento superovulatorio de hembras LT.

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización

El estudio se realizó en Veracruz, México, a 19^o11´ N y 96^o20´ O, a una altitud de 23 msnm, precipitación y temperatura medias anuales de 1060 mm y 26.4 ^oC. El clima corresponde al Aw (w)(i´) g, cálido subhúmedo con lluvias en verano [17].

Hembras experimentales

Se utilizaron 25 hembras donadoras LT con máximo dos partos de 47 ± 4 meses y 423 ± 12 kg. Todas las donadoras presentaron ciclos estrales regulares y fueron palpadas vía transrectal para descartar la presencia de quistes ováricos u otras anomalías de acuerdo con la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) [30]. La condición corporal media de las donadoras fue 3.2 ± 0.4 en escala de 1 (emaciado) a 5 (obeso) [48]. Las hembras experimentales donadoras y los sementales cuyo semen se utilizó para cubrir a las hembras, son animales genéticamente superiores en producción de leche a 305 d. Las pajillas utilizadas conteniendo 20 x 10⁶ espermatozoides fueron descongeladas y el semen fue inspeccionado con un microscopio (Axiostar Plus, ZEISS^®, LLC, New York, USA); y se determinó que presento movilidad individual progresiva superior de 60 %. Tres sementales se asignaron aleatoriamente para cubrir a las hembras, de acuerdo a la estructura de seis familias establecidas en el núcleo de selección, con el fin de evitar consanguinidad en la descendencia.

Manejo de donadoras

Las donadoras se alimentaron con estrella de África (Cynodon plectostachyus), pará (Brachiaria mutica) y grama nativa (Paspalum spp), se suplementaron con concentrado de 18 % de proteína cruda a razón de 2 kg d^-1 animal^-1y ensilado de maíz a razón de 15 kg d^-1 animal^-1, además recibieron sales minerales y agua a libertad. Se desparasitaron internamente vía oral (Paraxane al 10%, Biogénesis Bagó, S. A., Monte Grande, Buenos Aires Argentina, 5 ml por cada 100 kg de peso) y externamente (Bovitraz al 12.5%, Laboratorios Bayer S. A., D.F. México, 40 ml por cada 20 L de agua) por aspersión cada 20 d y recibieron dos aplicaciones de selenio (Mu Se®, Laboratorios Schering-Plough, Friesoythe, Alemania, 1 ml por cada 50 kg) y 15 ml de fósforo orgánico (Catosal, Laboratorios Bayer Health Care, Shawnee, KS, USA,) 30 y 10 d previos al inicio del protocolo de superovulación. La conducta de las donadoras se observó 1 h por la mañana y 1 h por la tarde durante dos ciclos y se determinó que todas presentaron ciclos estrales regulares en un intervalo de 18 a 24 d.

Protocolo de superovulación y tratamientos

Se utilizó un protocolo de superovulación a tiempo fijo (Figura 1). En el día cero a cada donadora se le insertó un dispositivo intravaginal liberador de progesterona (CIDR-B®, 1.9 g Dec. Manufacturing, Hamilton, Nueva Zelanda) y se mantuvo hasta el día siete y se le aplicaron 2.5 mg de Benzoato de estradiol (BE, Estrol, Loeffler, Instituto Agrobioquímico S.A. de C.V, D.F., México) y 50 mg de Progesterona (P_4, Lapisa, S.A de C.V. para Zoetis México S de R.L de C.V. D.F., México) de manera intramuscular. Del día cuatro al siete por la mañana y por la tarde se aplicaron dosis diarias decrecientes de FSH (Folltropin-V, NIH-FSH-P1, Bioniche Animal Health Inc., Belleville, Ontario, Canadá) que completaron niveles totales de 260 (FSH1, n=13) y 210 (FSH2, n=12) mg, que correspondieron a los dos tratamientos, cada uno asignado al azar a las hembras. El día seis por la mañana y por la tarde se aplicaron dosis intramusculares de 25 mg de PGF2α (Lutalyse, Dinoprost-trometamina, Pharmacia & Upjohn, Inc., Kalamazoo, Michigan, USA). El CIDR se retiró a las 24 h de aplicada la PGF2α y cada donadora recibió dosis intramusculares de 200 UI de eCG (Folligón, Intervet International, B.V. Boxmeer, Holanda) por la mañana y por la tarde. El día ocho por la mañana, 24 horas después de retirado el CIDR, se aplicó una dosis intramuscular de 0.25 mg de GnRH (Gonadorelina Fertagyl, Intervet International, Unterschleiβheim, Alemania). La primera IA se realizó a las 36 h de retirado el CIDR y la segunda 12 h después, utilizando en cada ocasión dos pajillas.

Superovulación de hembras criollas lechero tropical - Image 1

Recolección y clasificación de embriones

Los embriones se recolectaron por el método no quirúrgico [45] siete días después de realizada la IA. El número de cuerpos lúteos (CL) se determinó por palpación ovárica transrectal antes de iniciar el lavado. Las áreas epidural y perineal y los labios vulvares se desinfectaron con yodo espuma, yodo germisin (Farmaceuticos Altamirano de México, S.A de C.V. D.F. México) y alcohol al 70 %; el área epidural se anestesió con 5 a 10 mL de lidocaína al 2% (Astra Zeneca, S.A. de C.V. D.F. México). Los embriones se recolectaron con un catéter Foley de dos vías de 14 ó 20 fr con globo de 30 cc (C.R. Bard, Inc., Covington, GA, Malaysia), para el lavado se utilizó 1 L animal^-1 de medio de recolección (Vigro Complete Flush Solution, Bioniche Animal Health, Inc., Pullman WA, USA). Los embriones fueron recuperados en ambos cuernos con un filtro EmCon (Agtech, Inc., Spring Valley, WI, USA). Al finalizar la recolecta se aplicaron 25 mg de PGF2α animal^-1 para lisar los cuerpos lúteos existentes y evitar una posible gestación. Los embriones se localizaron utilizando un estereoscopio (ZS-6Plus, Bausch & Lomb, Rochester, NY, USA), se colocaron en un medio de mantenimiento (Vigro Holding Plus, Bioniche Animal Health, Inc., Pullman, WA, USA) y se clasificaron de acuerdo al grado de desarrollo embrionario [6]

Variables de respuesta

Las variables de respuesta se midieron de acuerdo a la clasificación descrita por Bó y Mapletoft [6]. Se consideró que la donadora respondió al tratamiento si presentó dos o más cuerpos lúteos identificados por palpación ovárica transrectal al momento de la recolección de embriones. Se midieron el número de cuerpos lúteos (CL), palpados de manera transrectal en cada ovario momentos antes de iniciar la recolecta de embriones, número de ovocitos no fertilizados (ONF), número de embriones degenerados (ED), número de embriones en estadio de blastocisto (B), número de embriones de calidad uno (EC1) –mórulas y blastocistos-, número de embriones transferibles (ET) -calidad uno y dos, mórulas y blastocistos- y número total de estructuras recolectadas (TER) –embriones de diferentes estadios, incluyendo ovocitos no fertilizados-.

Análisis estadístico

Las variables de respuesta se analizaron con un modelo lineal de efectos fijos:

donde;

γ_ij= observación j-ésima del i-ésimo tratamiento.

µ = constante que caracteriza a la población.

T_i = efecto fijo del i-ésimo tratamiento. i = 1, 2.

Β₁ = coeficiente de regresión que relaciona el peso vivo con la variable de respuesta.

x_1ij = peso vivo asociado a la variable de respuesta.

x_1... = media del peso vivo.

Β2 = coeficiente de regresión que relaciona la edad con la variable de respuesta.

x_2ij = edad asociada a la variable de respuesta.

x_2... = media de la edad.

Β3 = coeficiente de regresión que relaciona la condición corporal con la variable de respuesta.

x_3ij = condición corporal asociada a la variable de respuesta.

x_3... = media de la condición corporal.

ε_ij = error aleatorio. ε_ij˜ IIP (λ)

En un inicio se incluyó la pajilla del semental en el modelo, pero no tuvo efecto significativo en las variables de respuesta por lo que se eliminó. Los datos fueron procesados con el procedimiento GENMOD del SAS [42]. Se utilizó una distribución Poisson de los errores con función de enlace logística.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las medias estimadas de las variables de respuesta se muestran en el CUADRO 1. No se observó efecto de tratamientos (p>0.05) para CL. Sin embargo, las covariables peso (p≤0.006) y edad (p≤0.001) afectaron el número de CL con β = 4.4 x 10^-3± 1.6 x 10^-3 y β = -0.3 x 10^-3 ± 0.9 x 10^-3respectivamente.

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En una experiencia empírica con vacas de la raza LT, en la cual se utilizó una dosis de 160 mg de Folltropin-V para inducir superovulación, se observó que los animales no respondieron al tratamiento debido a la baja dosis. Hembras de diferentes genotipos han sido superovuladas utilizando diferentes dosis de Folltropin-V. El número de CL se ve afectado por la edad de la donadora, hembras con edades avanzadas manifiestan una menor ovulación [24] debido a que vacas de mayor edad presentan menos folículos ováricos pequeños reclutados en una onda folicular [28] y menos folículos grandes después de la superestimulación de los ovarios [29]. En contraste, donadoras muy jóvenes superovuladas con dosis altas de FSH presentan una sobreestimulación ovárica y como consecuencia una pobre ovulación [8]. Los CL obtenidos en FSH1 y FSH2 fueron mayores a los 8.2±0.6, 8.6±0.6 y 8.7±0.9 obtenidos en Sistani, vacas nativas de Bangladesh y Kamphaen Saen (Bos indicus) razas Bos indicus de Irán, Bangladesh y Tailandia con la aplicación de dosis bajas de 120, 200 y 200 mg de Folltropin-V [1, 4, 32], respectivamente. La alta respuesta de las razas cebuinas a la aplicación de dosis bajas de FSH es atribuible a un alto grado de sensibilidad del Bos indicus a la aplicación exógena [5]. Sin embargo para inducir superovulación en razas Bos taurus de gran formato de Canadá y Turquía como la Holstein Friesian y Suizo Pardo se han utilizado dosis altas de 400 mg de Folltropin-V [10, 35] obteniendo 8.7±2.0 y 9.1±1.8, resultados inferiores a los encontrados en este estudio (CUADRO 1). Aunque el número de CL obtenido entre los tratamientos de este estudio fue similar, se observó que hembras LT responden positivamente a la aplicación de una dosis moderada de FSH.

El nivel de Folltropin-V afectó (p≤0.004) el número de ONF, el mayor número de ONF se observó en FSH1. La covariable peso afectó (p≤0.03) los ONF con β = 1.4 x 10^-2 ± 7.1 x 10^-3. El número de ONF obtenido en FSH1 fue casi cinco veces mayor que en FSH2. Lopes da Costa et al. [27] obtuvieron 0.7±0.3 ONF en ganado nativo de raza Mertolenga de Portugal al aplicar 400 mg de Folltropin-V. Dong-Soo et al. [14] en vacas nativas de Corea con dosis de 28 y 24 mg de Artrin-R10 obtuvieron 2.1±0.5 y 2.2±0.5 ONF. El mayor número de ONF obtenido en el tratamiento FSH1 se asocia a la dosis alta de Folltropin-V por la cantidad de FSH/LH contenida en el producto. Al aumentar la dosis del producto conteniendo FSH aumenta de igual forma el contenido LH, la cual causa luteinización de folículos así como prematuras ovulaciones [21].

Los ED no fueron diferentes entre FSH1 y FSH2 (p>0.05). La covariable peso afectó (p≤0.02) los ED con β = 1.1 x 10^-2 ± 5.1 x 10^-3. Los valores de ED obtenidos en este estudio (CUADRO 1) fueron inferiores a los 2.7±1.7 y 3.2±0.2 obtenidos en vacas Gir y Brahaman de Colombia superovuladas con dosis de 200 y 240 mg de Folltropin-V [31, 39], pero similares a los 2.8±0.9 y 1.4±0.7 obtenidos en vacas Mertolengo de Portugal y vacas Suizo Pardo de Turquía superovuladas con dosis altas de 400 mg Folltropin-V [9, 34]. Dong-Soo et al. [14] de vacas nativas de Corea que recibieron 28 y 24 mg de FSH porcina (Sus scrofa) (ARtrin-R10) obtuvieron 0.8±0.2 y 1.0±0.3 ED. Aunque no se observaron diferencias entre tratamientos, la cantidad de ED obtenida en este estudio fue muy baja.

No se observaron diferencias entre tratamientos (p>0.05) para B y se encontró un número reducido de embriones en mórula y blastocisto expandido, lo cual puede estar relacionado al grado de desarrollo de los embriones por los días transcurridos desde la IA hasta el día siete de la recolecta. El grado de desarrollo de los embriones se relaciona a los días transcurridos desde la IA hasta el momento de la recolecta [6, 25]. Callesen et al. [11] en vacas lecheras superovuladas con FSH y eCG obtuvieron 1.4±0.6 B y Bono et al. [7] en vacas de carne superovuladas con Gonadotropina Menopáusica Humana (hMG) obtuvieron valores similares de 3.3±0.8 B, estos resultados son similares a los observados en este estudio.

No hubo efecto de tratamientos en EC1 (p>0.05). Sin embargo el número más alto de EC1 se observó en FSH2. En vacas Suizo Pardo que recibieron 400 mg de Folltropin-V se obtuvieron 2.9±1.3 EC1 [9]. Singh et al. [46] obtuvieron 4.1±0.7 EC1 en vaquillas Simmental con la aplicación de 9.0 mg de oFSH-17 (Ovagen). La aplicación de FSH2 fue capaz de inducir un número similar de EC1 comparado con FSH1 en este estudio.

No se observaron diferencias entre tratamientos (p>0.05) para ET. Sin embargo, se observó un número mayor con FSH2, el máximo número de ET fue siete en FSH1 y nueve en FSH2 y el mínimo fue cero en ambos tratamientos. ET es la variable de respuesta más importante de una ovulación múltiple ya que a mayor número de embriones transferibles se tiene mayor probabilidad de producir una gestación exitosa [43]. Los valores estimados de ET obtenidos (CUADRO 1) fueron similares a los 3.2±0.2, 2.7±1.1, 7.2±7.4, 4.0±2.4 y 4.4±3.9 obtenidos en vacas nativas de Bangladesh, Sistani, Gir, Kanphaeng Saen y Brahmán (Bos indicus), superovuladas con dosis bajas de 200, 120, 200, 200 y 400 mg [1, 4, 31, 32, 39] y Suizo Pardo, Mertolengo y Holstein Friesian (Bos taurus) superovuladas con dosis altas de 400 mg de Folltropin-V, respectivamente [10, 34, 35]. Sin embargo, Roa et al. [36] superovularon vacas de la raza Criollo Limonero en Venezuela y obtuvieron 2.2±0.4 ET, resultados similares a los de este estudio (CUADRO 1). Estrada et al. [15] superovularon vacas de diferentes razas criollas colombianas con dosis de 36 y 24 mg de Folltropin-V y el valor más alto que obtuvieron fue de 3.0±2.3 ET. Los resultados de este estudio son mayores de 1.3±1.2 ET obtenidos en vaquillas Bos taurus de genotipos lecheros no adaptados de 20-28 meses de edad y de 196-265 kg y superovuladas con diferentes gonadotropinas en un ambiente tropical [22]. No obstante a que no se observaron diferencias entre los tratamientos, es deseable obtener un número similar de ET utilizando dosis baja de FSH.

El TER no fue diferente entre tratamientos (p>0.05). La covariable peso influyó (p≤0.04) en TER con β = 5.7 x 10^-3± 2.8 x 10^-3. El TER se ve afectado por el peso de la donadora, debido a que en hembras de bajo peso se presenta una alteración en la secreción pulsátil de LH que perturba el proceso del desarrollo folicular a la fase preovulatoria [20]. Los resultados obtenidos (CUADRO 1) son similares a las 3.8±0.4, 4.7±1.4, 9.8±9.0, 6.7±1.2 y 9.1±5.6 TER en razas Bos indicus superovuladas con dosis bajas de 120, 200 y 240 mg de Folltropin-V [1, 4, 31, 32, 39]. Sin embargo, Nilchuen et al. [33] en vacas de la raza Kamphaeng Saen obtuvieron 14.3±3.6 TER con dosis de 200 mg de Folltropin-V. Vacas de razas Bos taurus fueron superovuladas con dosis altas de 400 mg de Folltropin-V [10, 34, 35] y se obtuvieron 6.3±1.4, 10.0±2.2 y 5.0±2.1 TER, similares a las de este estudio (CUADRO 1). Sin embargo Roa et al. [36] superovularon vacas Criollo Limonero utilizando dosis de 240 mg Folltropin-V y obtuvieron 3.1±0.5 TER, inferiores a las de este estudio (CUADRO 1). La buena respuesta a la aplicación de dosis moderada en FSH2 observada en este estudio, se ve reflejada en el número similar de TER con relación a FSH1.

CONCLUSIONES

El tratamiento FSH2 con dosis de 210 mg de Folltropin-V produjo el mismo número de embriones transferibles y embriones calidad uno que el tratamiento FSH1 con una dosis de 260 mg. A su vez, en el tratamiento FSH2 el número de ovocitos no fertilizados fue casi cinco veces inferior al tratamiento FSH1, por lo que el tratamiento FSH2 sería el más recomendable para superovular hembras CLT.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece la beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), México. Agradecimiento especial al Colegio de Postgraduados campus Montecillo, campus Veracruz y al Fideicomiso para la Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico No. 167304 en la modalidad de financiamiento a proyectos de investigación de tesis, por los recursos económicos aportados para esta investigación.

Superovulación de hembras criollas lechero tropical

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