Actividad antibacteriana de nanopartículas de plata contra un aislado de staphylococcus aureus multidroga-resistente obtenido de un caso de mastitis bovina

Introducción

La mastitis bovina es una inflamación de uno o varios cuartos mamarios, debida con mayor frecuencia a una infección intramamaria bacteriana. Es una de las enfermedades más importantes en el ganado lechero ya que reduce la producción de leche y altera su composición (Bradley, 2002). La principal forma de tratar la mastitis bovina actualmente, es la terapia con antibióticos, sin embargo, hay inconvenientes debidos entre otras causas a su uso con fines profilácticos, lo que favorece la selección de cepas resistentes en la población microbiana e influye negativamente en el tratamiento de la enfermedad.

Entre los agentes antimicrobianos inorgánicos, la plata ha sido ampliamente utilizada desde tiempos remotos para combatir infecciones (Pal et al., 2007). El uso de materiales con dimensiones en escala molecular, se ha venido incrementando en aplicaciones médicas para utilizarlas como agentes antimicrobianos (Sondi y Salopek, 2004).

Se ha reportado que las nanopartículas de plata poseen un enorme potencial para su uso médico, en virtud de su actividad antimicrobiana de amplio espectro incluyendo bacterias multidrogaresistentes, además de ser relativamente no tóxicas y seguras y requerir concentraciones muy bajas para conseguir un efecto microbicida (Panacek, A., et al., 2006). Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue probar el efecto microbicida de nanoparticulas de plata contra S. aureus multidroga-resistente aislado de mastitis bovina, utilizando distintos diluyentes, para observar el comportamiento de la nanoplata en cada uno de éstos.

Materiales y Métodos

Material biológico: La cepa S. aureus MDR se aisló de mastitis subclínica bovina, se identificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos diseñados de una región que codifica para el gen 23S ribosomal, y se le hizo prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos utilizando el método de difusión en agar Bio Rad Multidiscos Gram positivos® con 12 antibióticos. Es una cepa no susceptible a 6 antibióticos, entre ellos: 4 betalactámicos, 1 fluorquinolona y 1 macrólido, la cual se conserva liofilizada y criopreservada en glicerol al 10%. Para el ensayo se utilizó cultivo fresco en fase exponencial en caldo Todd Hewitt. Al momento de comenzar el ensayo se diluyó con PBS 0.01M hasta obtener una turbidez 0.5 del estándar McFarland, lo que equivale a 1.5 x 10⁸ ufc/ml aproximadamente y se probó con diferentes concentraciones de nanoplata.

Nanopartículas de Ag: Son nanoparticulas comerciales de la marca Argovit esféricas de 3 nm de diámetro cubiertas con el polímero polivinilpirrolidona (PVP).

Medios diluyentes: Los medios diluyentes a probar fueron: Agua ultra pura, Solución buffer fosfato (PBS) 0.01M (pH 7.4), Caldo Todd Hewitt (pH 7.8±0.2) y leche descremada al 10% (pH 6.3 ± 0.2).

Aplicación de nanoplata in vitro: El ensayo se realizó en microplacas estériles de polietileno de 330µl. Aproximadamente 10⁶ ufc/ml de S. aureus en fase exponencial se inocularon, luego se agregaron distintas concentraciones de nanoplata. La más baja fue de 0.5 µg/ml y la más alta de 32 µg/ml de un stock de 32µg/ml diluido en cada uno de los medios. Además se incluyeron controles positivos y negativos, el primero fue bacteria en medio sin nanoplata y el segundo fue solamente medio. Se aforó cada muestra a 300µl con el medio correspondiente, todos estos pasos se llevaron a cabo con condición aséptica en una cabina de flujo de aire laminar. Después se incubó por distintos tiempos, el tiempo más corto fue de 30 minutos y el más prolongado fue de 16 horas, a 37°C a 200rpm, en ambiente estéril.

Ensayo de actividad antimicrobiana de nanoparticulas de plata contra S. aureus MDR: Para evaluar la CMB de la nanoplata, se inocularon 10µl de cada muestra al término de su tiempo de incubación correspondiente en cajas de Petri con agar Todd Hewitt y se incubaron por 24 hrs a 37 °C.

Resultados y discusión

Utilizando agua ultrapura la CMB fue de 4µg/ml desde los 30 minutos, sin embargo este corto tiempo pudo deberse a que no era un ambiente óptimo y sin nutrientes para las bacterias, en cambio se obtuvo una CMB de 8µg/ml a las dos horas en el medio de PBS 0.01M, tampoco tenían nutrientes pero al ser un medio isotónico no es un medio tóxico, en el medio de leche descremada la CMB fue de 16µg/ml a las dos horas de incubación, con este medio tardó un poco más en lisar en comparación con los medios anteriores, posiblemente porque es un medio con nutrientes donde se desarrollan con facilidad las bacterias. En caldo, al ser este un medio rico en nutrientes, posiblemente no pudo actuar eficientemente la nanoplata, lo mismo pudo haber sucedido con el caldo Todd Hewitt ya que no hubo lisis en ninguna concentración.

El ensayo que presentamos es similar al de Suchomel y colab. (2015) y al de Kvitek y colab. (2008) donde también probaron nanoplata cubierta con PVP contra S. aureus pero solo utilizaron caldo Muller Hinton como medio diluyente, en nuestro ensayo probamos con distintos medios. Sin embargo la concentración mínima inhibitoria (MIC, por sus siglas en inglés) del ensayo de Suchomel y colab. fue de 10.1µg/ml y en el de Kvitek y colab. fue de 3.38µg/ml, ambos expusieron la bacteria con la nanoplata por 24 horas, en nuestro trabajo el tiempo máximo fue de 16 horas, además la MIC de nuestro ensayo debió haber sido menor que la CMB que obtuvimos, por lo que es necesario para ensayos posteriores determinar la MIC e incubar hasta 24 horas para poder discriminar con mayor precisión la MIC y la CMB.

La intención de probar con distintos medios en nuestro ensayo fue para observar el comportamiento de la nanoplata, con el objetivo de en un futuro poder utilizarlos como vehículo para la aplicación intramamaria en las vacas infectadas con mastitis o como preventivo. Al obtener estos resultados, descubrimos que la nanoplata utilizada si posee efecto microbicida contra S. aureus MDR a concentraciones muy inferiores a las de antibióticos comunes de uso veterinario.

Actividad antibacteriana de nanoplata en distintas concentraciones, tiempos de incubación y medios diluyentes. (+++, ++, + = Crecimiento bacteriano. - = Lisis total).

Actividad antibacteriana de nanopartículas de plata contra un aislado de staphylococcus aureus multidroga-resistente obtenido de un caso de mastitis bovina - Image 1

Literatura Citada

Bradley, A. 2002. Bovine mastitis an evolving disease. Vet. J. 164:116-126.

Kvitek, L., A. Panacek, J. Soukupova, M. Kolar, R. Vecerova, R. Prucek, M. Holecova and R. Zboril. 2008. Effect of surfactants and polymers on stability and antimicrobial activity of silver nanoparticles (NPs). J. Phys. Chem 112: 5825-5834.

Pal, S., Y. K. Tak and J. M. Song. 2007. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 73(6) 1712-1720.

Panacek, A., L. Kvitek and R. Prucek. 2006. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization and their antibacterial activity. J. Phys. Chem. B. 110:16248–16253.

Sondi, S. and B. Salopek-Sondi. 2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of colloid and Interfase Sciencie. 275:177-182.

Suchomel, P., L. Kvitek, A. Panacek, R. Prucek, J. Hrbac, R. Vecerova and R. Zboril. 2015. Comparative study of antimicrobial activity of AgBr and Ag Nanoparticles (NPs). PLoS ONE 10(3): e0119202.

Introducción

Materiales y Métodos

Nanopartículas de Ag: Son nanoparticulas comerciales de la marca Argovit esféricas de 3 nm de diámetro cubiertas con el polímero polivinilpirrolidona (PVP).

Medios diluyentes: Los medios diluyentes a probar fueron: Agua ultra pura, Solución buffer fosfato (PBS) 0.01M (pH 7.4), Caldo Todd Hewitt (pH 7.8±0.2) y leche descremada al 10% (pH 6.3 ± 0.2).

Resultados y discusión

Actividad antibacteriana de nanoplata en distintas concentraciones, tiempos de incubación y medios diluyentes. (+++, ++, + = Crecimiento bacteriano. - = Lisis total).

Literatura Citada

Bradley, A. 2002. Bovine mastitis an evolving disease. Vet. J. 164:116-126.

Panacek, A., L. Kvitek and R. Prucek. 2006. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization and their antibacterial activity. J. Phys. Chem. B. 110:16248–16253.

Suchomel, P., L. Kvitek, A. Panacek, R. Prucek, J. Hrbac, R. Vecerova and R. Zboril. 2015. Comparative study of antimicrobial activity of AgBr and Ag Nanoparticles (NPs). PLoS ONE 10(3): e0119202.

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FIGAP - Exposición Internacional

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