Introducción
En la actualidad se realizan esfuerzos enca-minados a diversificar la oferta forrajera en los sistemas ganaderos tradicionales y se promueve la implementación de sistemas silvopastoriles, entre los que se destaca de manera particular Tithonia di-versifolia (Hemsl.) A. Gray (Gallego-Castro et al.,2017a), la cual puede constituir una buena alternati-va en la alimentación del ganado.
Entre sus características nutricionales se destaca el contenido de proteína, los carbohidratos solubles y el contenido de taninos, indicadores importantes que deben analizarse, ya que estos componentes pueden ayudar a mejorar el balance alimenticio en cuanto al aporte de energía y proteína en la dieta del ganado lechero (Gallego-Castro et al., 2017b; Mahecha-Ledesma y Angulo-Arizala, 2017).
A su vez, el aporte de proteína puede contri-buir a mejorar el balance ruminal e incrementar la eficiencia para la transformación del amoníaco en proteína microbiana, lo que implicaría menores costos energéticos por pérdidas de amoníaco, me-tano y CO2 ruminales, que disminuyen la posible contaminación ambiental.
En cuanto a los metabolitos secundarios, Galindo et al. (2017) informaron que la presencia de fenoles totales, taninos, saponinas, entre otros compuestos, es variable en la planta. Así mismo, Hess (2006) señaló que los taninos están asociados con la reducción en la producción de metano; ello coincide con lo reportado por Galindo et al. (2012), quienes hallaron que la inclusión de 10 y 20 % de T. diversifolia produjo reducciones en la poblaciónde metanógenos ruminales.
Gallego-Castro (2016) demostró que un siste-ma silvopastoril (SSP) de T. diversifolia asociado con kikuyo incrementó la producción de leche, así como su calidad. En este sentido, García-López etal. (2016) también hallaron incrementos en la pro-ducción cuando utilizaron un SSP con esta especie.
Las características nutricionales de T. diversi-folia ejercen un efecto importante en el rendimientoproductivo de los animales; sin embargo, los estu-dios relacionados con su influencia sobre la eco-logía ruminal se han conducido en condiciones invitro e in situ, y no existen reportes de su efecto encondiciones de producción. De ahí que el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de un sistema silvopastoril con T. diversifolia, asociada a una mezcla de gramíneas tropicales, sobre la población microbiana ruminal en vacas lecheras en condicio-nes de producción.
Materiales y Métodos
Localización. El experimento se realizó duran-te los años 2012-2016, en las áreas de pastoreo de la unidad lechera G-2, ubicada entre los 22º 54ʹ 44.94ʺ LN y los 82º 00ʹ 38.34ʺ LW y a 83 msnm: dicha uni-dad pertenece al Instituto de Ciencia Animal (ICA), en el municipio de San José de las Lajas –provincia Mayabeque, Cuba.
Características edafoclimáticas. Las áreasexperimentales se encuentran situadas sobre un suelo Ferrálico Rojo éutrico de rápida desecación, arcilloso y profundo sobre calizas, equivalente al subtipo Cambisol ferralico rodico (Hernández-Jiménez et al., 2015). La temperatura media anual de la región fue de 24,9 ºC. Se registraron máximas entre los 32,7 y 33,5 ºC, y mínimas entre los 21,5 y 22,5 ºC. La precipitación media anual fue de 1 361 mm, y la humedad relativa promedio anual, de 80,9 % (Estación Meteorológica del Instituto de Ciencia Animal, San José de las Lajas, Mayabeque).
Siembra y establecimiento. El sistema SPP de T. diversifolia se sembró de forma estratificada, du-rante los años 2011-2013, en un área de 9 ha. Con posterioridad se sembraron 20,4 ha durante los años 2015 y 2016 hasta completar un total de 29,4 ha. Como material de propagación se utilizó material vegetal del banco de germoplasma del ICA, según lo propuesto por Ruiz et al. (2014) para su utiliza-ción en sistemas de pastoreo. Se realizó una pre-paración convencional del suelo durante el periodo lluvioso, en doble surcos a 0,5 m entre ellos, con una distancia de espaciamiento de 4 m. En el caso de las gramíneas, estas se regeneraron del material presente en el suelo.
Co mposición florística del pastizal. Durantemás de 15 años esta área de la unidad (53,6 ha) estuvo empastada con una mezcla de gramíneas tropicales integrada por Cynodon nlemfuensis (pasto estrella), Megathyrsus maximus (Jacq.) (guinea) y mezcla depastos naturales, con predominio de Dichanthiumcaricosum y Sporobolus indicus. El SSP seestableció con una densidad de 6 912 plantas de T.diversifolia ha-1. La proporción estimada del estratoarbóreo-herbáceo en una hectárea fue de 20:80, respectivamente.
Manejo de los animales y pastoreo. Se utilizaron100 vacas Holstein, las que pastaron en un sistema de punteros y continuadores, con tiempo de estancia en el cuartón de SSP de dos días. El pastoreo fue nocturno y los animales permanecieron desde las 5:00 p.m. hasta las 5:00 a.m. En el horario de la mañana pastaban la mezcla de gramíneas. Cada uno de los ciclos de pastoreo en el SSP tuvo una duración de 15-20 días. Al finalizar, los animales pastaron en el resto del área de las gramíneas hasta completar 80-90 días de descanso para la arbórea, y la carga animal fue de 2,2 a 2,7 vacas ha-1.
Procedimiento experimental
Las vacas tuvieron un período de adaptación a la dieta (SSP o gramíneas) de 10 días, antes de cada uno de los muestreos del líquido ruminal. En cada ciclo de muestreo se trabajó con seis vacas.
Los muestreos del líquido ruminal se efec-tuaron después del ordeño de la mañana, con una sonda esofágica. El líquido ruminal que se colectó fue guardado en termos con cierre hermético, para garantizar las condiciones de temperatura (39 ºC) y anaerobiosis durante el traslado al laboratorio.
La composición química de T. diversifolia presentó valores de 24,2; 5,9; 2,3; 0,4; 35,3 y 30,4 % para PB, ceniza, calcio, fósforo, fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA), respectivamente.
Esta planta en las pruebas cualitativas del tamizaje fitoquímico presentó moderadas concentraciones de taninos (++), saponinas (++), triterpenos (++), esteroides (++) y alcaloides (++); así como altas concentraciones de reductores (+++) y bajas de antocianidinas (+).
Análisis y determinaciones
Cultivo de microorganismos del rumen. Seutilizó la técnica de cultivo de Hungate (1950), en tubos rodados y en condiciones de anaerobiosis estricta. La siembra de bacterias viables totales, celulolíticas y proteolíticas se efectuó en los medios de cultivo de Caldwell y Bryant (1966). En el caso de las bacterias proteolíticas, se adicionó un 10 % de leche descremada. Para la determinación de la población de hongos se empleó el medio de cultivo de Joblin (1981). Los microorganismos metanogénicos se cultivaron mediante la misma técnica, con una mezcla de los gases hidrógeno y dióxido de carbono en relación 60:40. Los resultados se expresaron en unidades formadoras de colonia (UFC) para las bacterias y en unidades formadoras de talo (UFT) para los hongos por mililitro de líquido del rumen (mL) en la dilución determinada.
Los protozoos se contaron directamente al microscopio óptico en cámara de Neubauer, después de teñirlos con una solución de violeta genciana al 0,01 % en ácido acético glacial. De igual manera, los conteos se expresaron como células por mililitro de líquido del rumen (mL) en la dilución determinada. Para realizar los conteos de protozoos estos se preservaron en una solución de formol al 10 % en una dilución 1:1 (v/v).
El pH se determinó mediante lectura en pH metro digital marca Sartorius®.
La concentración de NH3 se determinó según la técnica descrita por Conway (1957). La concen-tración de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y los ácidos grasos individuales se determinaron me-diante cromatografía gaseosa.
Cálculo del balance estequiométrico de la fermentación ruminal. Se utilizó el programa BA-LANCE-RUMETANO para estimar el balance estequiométrico de la fermentación ruminal y la contribución al metabolismo animal (Stuart, 2015). Igualmente, se calculó la biomasa bacteriana (BB) y la materia orgánica fermentada en rumen (MOf).
Procesamiento estadístico. Se verificaron lossupuestos teóricos del análisis de varianza para las variables en estudio, a partir de las dócimas de Sha-piro Wilk (1965) para la normalidad de los errores y de Levene (1960) para la homogeneidad de varian-za; mientras que los conteos de microorganismos viables se transformaron según ln N, con el fin de garantizar las condiciones de normalidad en la cur-va de crecimiento. En el análisis se aplicó la fórmula (K + N).10x, donde: K es la constante que representa el logaritmo de la dilución en la cual se inoculó el microorganismo; N es el logaritmo del conteo de colonias determinado como UFC mL-1, UFT mL-1 o células mL-1; 10 es la base de los logaritmos y x es la dilución a la cual se efectuó la inoculación; los conteos de microrganismos no cumplieron con los supuestos teóricos del ANOVA, por lo que se empleó para el análisis la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Se utilizó el programa estadístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2012).
Resultados
En la tabla 1 se muestra el efecto del pastoreo en el SSP con T. diversifolia sobre las poblaciones de microorganismos del rumen, respecto al pas-toreo de gramíneas. Las poblaciones de bacterias viables totales, amilolíticas y celulolíticas fueron más numerosas, con diferencias estadísticas signi-ficativas cuando las vacas pastaron sobre el SSP en relación con el pastoreo de gramíneas. Asimismo, en T. diversifolia se redujo la población de proto-zoos del rumen. A su vez, no hubo efecto del SSP en las poblaciones de bacterias proteolíticas y hon-gos celulíticos del rumen; mientras que se encontró efecto depresivo, con diferencias significativas, en los metanógenos ruminales. Cuando las vacas pas-taron en T. diversifolia , se observó una reducción en aproximadamente dos veces en la población de mi-croorganismos que producen metano en el rumen.
En relación con el pH del líquido del rumen, se encontraron valores altamente significativos (p < 0,0001) cuando las vacas pastaron en el SSP (tabla 2). Este efecto se puede atribuir al incremento en la concentración de amoníaco ruminal, debido al elevado tenor en PB de T. diversifolia.
En cuanto a los ácidos grasos de cadena corta, se observó mayor concentración en los ácidos gra-sos volátiles totales (AGCC t), acético, propiónico e isobutírico cuando los animales pastaban en este sistema. Además, la concentración de ácido valé-rico fue altamente significativa (p < 0,0001) en los animales que pastaron en el SSP.
Tabla 1. Efecto del pastoreo en SSP con T. diversifolia en las poblaciones microbianas del rumen en vacas lecheras.
Tabla 2. Efecto del pastoreo en SSP con T. diversifolia, sobre el pH y los productos finales de la fermentación en vacas lecheras.
La cantidad de biomasa microbiana en el ru-men de las vacas que pastaron en el SSP y en las gramíneas fue de 196,9 y 192,3 g, respectivamente. A su vez, la cantidad de materia orgánica que se fermentó tuvo valores de 547,2 y 506,4 g para SSP y gramíneas, respectivamente.
En la tabla 3 se muestran los resultados obteni-dos a partir del cálculo del balance estequiométrico de la fermentación ruminal y los patrones de fer-mentación. El patrón de fermentación fue acético, tal y como se produce en el rumen de animales que consumen dietas fibrosas, con porcentajes molares de 66,7 y 64,0 % para los animales que pastaban en SSP y en gramíneas, respectivamente, sin diferen-cias entre ambos pastoreos. No se apreciaron dife-rencias estadísticas en el aporte en glucosa, dióxido de carbono, metano y agua, calculado a partir de la concentración de ácidos grasos volátiles.
Discusión
T. diversifolia se destaca por su capacidad parala acumulación de nitrógeno (Ruiz et al., 2017) y por sus características nutricionales, tales como: el contenido de proteína, los carbohidratos solubles (Mejías- Díaz et al., 2017) y el contenido de taninos (La O et al., 2012); los que pueden contribuir a me-jorar el balance nutricional en los animales, en rela-ción con el aporte de energía y proteína en la dieta del ganado lechero. A ello se añade que estudios realizados por Sauvant et al. (2011), a partir de una compilación de 59 experimentos, mostraron que la producción de CH4 por kilogramo de MO digerida disminuyó de manera lineal cuando se incrementó el contenido en PC de los alimentos (CH4 , g/kg MO digestible = 40,1 – 0,32 × PC, porcentaje de MS).
En el presente experimento se demostró un efecto depresivo en la población de protozoos cuando las vacas pastaron sobre el SSP con T. di-versifolia. Al respecto, se ha demostrado que losmetabolitos secundarios de estas plantas ejercen efectos defaunantes, al reducir la población de pro-tozoos del rumen.
Tabla 3. Efecto del pastoreo en SSP con T. diversifolia, sobre el patrón de fermentación y balance estequiométrico del rumen en vacas lecheras.
Galindo et al. (2017) indicaron que dicho efecto es directo sobre la población de protozoos e indi-recto sobre las bacterias celulolíticas, debido a que los protozoos engolfan enormes cantidades de estos grupos microbianos durante el día y, consecuente-mente, mejoran la eficiencia digestiva. De igual ma-nera, protegen de forma natural la proteína, lo que reduce su fermentación en el rumen.
El efecto hallado en el incremento de la po-blación de bacterias viables totales pudo tener su explicación en que la defaunación incrementa la población de bacterias viables totales en el rumen, según reportes de Galindo et al. (2014). Los autores han indicado que los protozoarios ingieren grandes volúmenes de bacterias y mantienen constante su población en el rumen, de modo que la defaunación implica la desaparición de las relaciones ecológicas (predación y competencia) que afectan el tipo, la dis-tribución genérica y la actividad metabólica de la po-blación fúngica y bacterial del ecosistema ruminal.
De igual manera, los protozoos ejercen acción depredadora selectiva sobre determinadas bacterias celulolíticas del rumen (Leguizamón y Carreño, 2013). Los protozoos del tipo A, entre ellos Polyplastrom multivesiculatum, actúan como predadores de las bacterias celulolíticas, tales como Butyrivibrio fibrisolvens y Ruminococcusflavefaciens; mientras que los protozoos del tipo B,como Epidinium ecaudatum, Eremoplastron bovis y Eudiplodinium maggii, actúan como predadores de las bacterias celulolíticas a una velocidad menor.
Entre las ventajas más importantes de la defaunación se encuentran: los incrementos en la población de microorganismos celulolíticos, la estabilización del pH del rumen, el decrecimiento del amoníaco libre, la reducción de la metanogénesis, y el incremento en la eficiencia de utilización digestiva de diferentes dietas, fundamentalmente las fibrosas. Estos resultados coinciden con reportes de compilación de Hristov (2013), en los cuales se asevera que el aporte más sobresaliente de la reducción de protozoos en el rumen es que mejora el metabolismo energético y reduce las pérdidas por concepto de producción de metano, que es un contaminante ambiental. Tal efecto quedó demostrado en esta investigación.
Leng (2014) informó que la defaunación redu-ce la emisión entérica de CH4, debido al flujo de células microbianas desde el rumen y a la reduc-ción en la relación acetato/propionato, eventos que se consideran sumideros de electrones. En esta in-vestigación, al calcular las relaciones entre los dife-rentes ácidos grasos en el rumen, se encontró que la relación acético/AGCCt fue de 0,64 y 0,62 para la fermentación de T. diversifolia y gramíneas, res-pectivamente; mientras que la relación propiónico/ AGCCt fue de 0,17 y 0,16 para el rumen de los ani-males que pastaron en T. diversifolia y gramíneas, respectivamente. Por su parte, la relación acético/ propiónico fue de 3,85 y 3,84 para el rumen cuando los animales pastaban en T. diversifolia y gramí-neas, respectivamente.
Reportes de Ramírez et al. (2014) aseveran que la relación existente entre metanógenos y protozoos constituye un ejemplo fehaciente de la transferencia de H2entre especies ruminales. Se ha detectado la presencia de metanógenos en la superficie de pro-tozoos ciliados del rumen y como endosimbiontes dentro de estos, y se ha estimado que dicha presen-cia es responsable del 9 al 25 % de la metanogé-nesis en el líquido ruminal. Dado que en el rumen no es posible la respiración aeróbica, los protozoos no contienen mitocondrias, sino organelas intrace-lulares denominadas hidrogenosomas, en las que se libera el H 2 que se produce durante la oxidación del piruvato o malato. Se ha observado una estrecha re-lación entre los metanógenos y las hidrogenosomas. La ventaja de esta cooperación para el protozoario es evidente: la eliminación de H2 permite que el pro-tozoo fermente la materia orgánica hasta acetato y CO2, lo que evita la generación de productos redu-cidos como etanol y lactato, proceso que permite obtener una máxima producción de ATP.
La respuesta al uso de SSP con T. diversifolia en relación con el efecto depresivo en la población de metanógenos puede tener su explicación en el hecho de que estos viven en forma endosimbióti-ca sobre los protozoos del rumen (Galindo et al., 2012), y cualquier efecto que contribuya a elimi-nar los protozoos del rumen contribuirá de manera decisiva a reducir las poblaciones productoras de metano. Se conoce que las Archaea metanógenas son microrganismos estrictamente anaeróbicos, principalmente pertenece al orden Metanobacterial (Ramírez et al., 2014). De cualquier manera, las re-laciones microbianas en el rumen son complejas, y mucho más aún lo son las rutas fermentativas que utilizan o producen H2, ya que los microorganismos pueden cambiar sus patrones de fermentación en respuesta a pequeñas diferencias en la conservación de energía, dejando de utilizar rutas termodinámi-camente menos favorables.
Lo anteriormente planteado pudiera explicar la respuesta hallada en la concentración de ácido isovalérico y valérico en el rumen cuando las vacas consumieron gramíneas, en relación con aquellas que accedieron al pastoreo con T. diversifolia, de-bido a que se ha demostrado que el aumento en la presión parcial de hidrógeno en el rumen también reduce la desaminación de aminoácidos reducidos, incluyendo los de cadena ramificada.
Los resultados de las relaciones entre los AGCC en el rumen parecen indicar que el mecanis-mo mediante el cual el follaje de esta planta actúa es muy complejo e implica otros factores, tal como la degradabilidad de la proteína en el rumen. Leng (2014) propuso un posible mecanismo mediante el cual las proteínas solubles propician mayores volú-menes de metano en rumen, mientras que aquellas menos solubles pueden pasar a las partes bajas del TGI.
Por otro lado, Rodríguez et al. (2014) señala-ron que cuando se suplementa con follaje de árboles o arbustos se producen incrementos en la proteína bacteriana y proteína sobrepasante, se reduce la de-gradación de las proteínas y se incrementa su flu-jo al duodeno, lo cual asegura mayor absorción de nitrógeno. Esto cambia de manera importante los conceptos evaluados hasta el presente, y se le atri-buye un lugar preponderante al metabolismo de las proteínas en el rumen cuando los animales pastan en sistemas silvopastoriles.
Conclusiones
El sistema silvopastoril con T. diversifolia mejoró el ecosistema ruminal, al incrementar los organismos degradadores de la fibra y reducir los metanógenos y protozoarios, aspecto importante que contribuye a incrementar la eficiencia de uti-lización de los nutrientes y minimizar las pérdidas energéticas en los rumiantes. De igual manera, se pone a disposición del animal mayor cantidad de materia orgánica fermentada para la síntesis de pro-teína microbiana.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la contribución de los técnicos Onidia Moreira, Aned Capó y Lucía Sarduy; y de los trabajadores de la vaquería G-2 del Instituto de Ciencia Animal, sin los cuales esta in-vestigación no se hubiera podido realizar.
