Presencia y resistencia antimicrobiana de Escherichia coli BLEE en muestras fecales de bovinos productores de leche al norte de Ecuador

1. Introducción

Escherichia coli es una bacteria anaerobia facultativa, habitante comensal del intestino de animales de sangre caliente (McVey et al., 2022; Winn et al., 2013). Existen cepas con la capacidad de causar infecciones intestinales y extraintestinales (Mueller y Tainter, 2023). Esta bacteria es capaz de causar colibacilosis en animales de granja y, adicionalmente, estos animales funcionan como reservorio de cepas patógenas (Bélanger et al., 2011). Se ha reportado que existen patotipos que también contienen genes de resistencia a betalactámicos (Tabaran et al., 2022; Yang et al., 2017).

La resistencia a los antimicrobianos [RAM] es un proceso por el cual los microorganismos evolucionan para sobrevivir al ataque de los antibióticos (World Health Organization [WHO], 2021c). Existen diversos factores que influyen para considerar a las RAM como un grave problema de salud pública (WHO, 2021c). Uno de ellos es el uso indiscriminado de antibióticos en el ámbito veterinario de manera terapéutica, profiláctica y/o como promotores del crecimiento (Walsh, 2018). Este hecho promueve una mayor presión selectiva sobre los microorganismos, ocasionando la propagación de bacterias farmacorresistentes (Palma et al., 2020). En entornos hospitalarios, la incidencia de pacientes que no responden a fármacos antibacterianos ha ido en aumento (Genovese et al., 2020). Se reporta que E. coli BLEE (productor de betalactamasas de espectro extendido) es una de las bacterias responsables de infecciones difíciles de tratar (WHO, 2021a). En Ecuador se aisló E. coli, resistente a cefalosporinas, en un 40 % en hospitales públicos, en el 2017 (Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública [INSPI, 2018). También se debe considerar el impacto económico de las RAM en los sistemas de salud, ya que aumentan los costos de atención médica hasta en un 25 % (WHO, 2021b). Hay que tomar en cuenta que la contaminación cruzada de estas cepas en los procesos de faena o preparación de los alimentos podría suponer un grave riesgo a la salud de los consumidores (Yang et al., 2017).

Para frenar el avance de las RAM se ha restringido el uso de antibióticos como promotores de crecimiento en animales de abasto en la Unión Europea desde el 2006 (European Commission, 2005). Según la Organización Panamericana de La Salud (OPS, 2021), algunos países miembros han instaurado medidas de control para la venta de productos veterinarios que contengan colistina en su formulación.

En general, la diseminación de E. coli BLEE se puede atribuir a factores relacionados con los alimentos y el contacto con animales domésticos (Chong et al., 2018). Varios estudios han demostrado que existe la presencia de E. coli BLEE en carne bovina y productos lácteos (Cebeci, 2022; Dorado-García et al., 2018; Egervärn et al., 2014; Kaesbohrer et al., 2019). Por ende, la cadena de producción de alimentos de origen animal cumple un papel fundamental para la diseminación de este patógeno en la comunidad (Doi et al., 2017). En Europa se han descrito enterobacterias productoras de betalactamasas en bovinos en 16 países (Dantas Palmeira y Ferreira, 2020).

Por otro lado, investigaciones realizadas en el entorno sudamericano han detectado prevalencia en bovinos de E. coli BLEE en un 18 % en Brasil; 48 % en Perú y 3 % en Chile (Benavides et al., 2021).

Las betalactamasas son capaces de inactivar antibióticos betalactámicos como las penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y carbapenémicos (Zhang y Cheng, 2022). Comúnmente a las BLEE se las reconoce por su familia enzimática; así tenemos a la familia TEM, SHV, CTX- M (Castanheira et al., 2021).

El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de E. coli BLEE e identificar los patrones de resistencia antimicrobiana aislada de muestras fecales provenientes de bovinos productores de leche de la provincia de Pichincha.

2. Materiales y Métodos

2.1. Diseño del estudio

La investigación fue de tipo observacional descriptivo y transversal. Se analizaron un total 182 muestras de heces de bovinos, 112 muestras de bovinos faenados en el Camal Metropolitano de la provincia de Pichincha recolectadas durante 4 meses y 70 muestras de la colección de la Unidad de Investigación de Enfermedades Transmitidas por Alimentos y Resistencias a los Antimicrobianos [UNIETAR], que fueron tomadas del proyecto “Estudio de resistencias a los antibióticos de Escherichia coli BLEE/AmpC aislado de muestras fecales de ganado bovino lechero en tres provincias del Ecuador”, en colaboración con AGROCALIDAD. El aislamiento de Escherichia coli BLEE se realizó en UNIETAR, ubicado en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.

2.2. Aislamiento de Escherichia coli BLEE

Para el aislamiento se utilizaron 25 gramos de muestra fecal, se agregaron 225 ml del caldo BPW (Buffered Peptone Water) e incubó a 37°C por 24 horas. Se realizaron estriaciones por agotamiento de la muestra en agar TBX (Tryptone bile X-Glucoronide) más cefotaxim e incubó a 37°C por 24 horas.

2.3. Identificación bioquímica

Se inoculó con una aguja de platino en el medio TSI [Triple Sugar Iron], se incubó a 37°C por 24 horas. Posteriormente se confirmó la reacción fenotípica característica de E. coli. Los aislados definidos como E. coli se refrigeraron para su posterior análisis.

2.4. Antibiograma por la técnica de Kirby-Bauer

Se sembraron las colonias positivas de E. coli en Agar nutritivo [AN] y posteriormente se incubo a 37°C por 24 horas. Se realizó la suspensión a partir del crecimiento en AN; con un asa estéril se tomó de 3 a 4 colonias semejantes y se las suspendió en un tubo con solución salina estéril (4-5 ml). Con un densitómetro se estandarizó la suspensión a una densidad de 0,5 McFarland. A continuación, se introdujo un hisopo estéril en la suspensión y se retiró el exceso de líquido. Se distribuyó el inóculo sobre la superficie completa del agar MH inoculándolo en tres direcciones (horizontal, vertical, diagonal) y hasta los bordes de la caja.

Se emplearon los discos de antibióticos con un aplicador o pinza estéril; se utilizaron discos de antibióticos de ceftazidima 30 µg, cefepime 30 µg, ciprofloxacina 5 µg, amikacina 30 µg, amoxicilina más ácido clavulánico 30 µg, fosfomicina 200 µg, nitrofurantoína 300 µg, trimetoprim más sulfametoxazol 25 µg, gentamicina 10 µg, ertapenem 10 µg, tigeciclina 15 µg, tetraciclina 30 µg, cloranfenicol 30 µg y cefoxitin 30 µg y se incubó las cajas a 37°C por 16-20 horas.

La interpretación de sensibilidad se realizó mediante la medición de los halos de inhibición con un calibrador automático y se interpretó los diámetros mediante las tablas de puntos de corte establecidos en el manual M100 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2023).

3. Resultados

Se realizó el análisis de 182 muestras fecales de bovinos productores de leche en Agar TBX más cefotaxima (TBX+C) (3 mg/l) para el aislamiento de E. coli. Se logró identificar 93 muestras positivas a E. coli BLEE (51 %, IC95% = 43-58), observándose el crecimiento de colonias de coloración azul verdosas. Todas las colonias seleccionadas fueron confirmadas en TSI (Figura 1).

Figura 1 Colonias de E. coli de color azul verdoso en agar TBX+C

3.1. Análisis de resistencia fenotípica a los antibióticos de las cepas de E. coli BLEE de origen bovino

En los antibiogramas se observó que los antibióticos con un mayor porcentaje de resistencia fueron: amoxicilina más ácido clavulánico, cefepime, ceftazidima, ciprofloxacina, amikacina y tetraciclina con porcentajes de resistencia que fueron del 80,6 % al 97,8 %. Por otra parte, los antibióticos para los cuales se obtuvo una menor resistencia fueron: ertapenem, cefoxitin y nitrofurantoina con porcentajes de resistencia entre el 2,2 % y el 10,8 %. Ninguno de los aislados fue resistente a la tigeciclina (Tabla 1).

Tabla 1 Resultados del análisis de antibiogramas en 93 cepas de E. coli BLEE de origen bovino

3.2. Análisis de patrones y genes de resistencia en E. coli de origen bovino

Al analizar la resistencia fenotípica de los 93 aislados, se obtuvieron 35 grupos de resistencia. Los más prevalentes fueron los que presentaron resistencia a 7 familias de antibióticos (10 grupos con 29 aislados) como se muestra en la Tabla 2. Solo un aislado presentó resistencia a 9 familias de antibióticos.

Todos los aislados analizados presentaron fenotipos multirresistentes. El patrón más frecuente fue ABEFMTX (aminoglucósido, betalactámicos, fenicoles, fluoroquinolonas, combinación de agentes betalactámicos, tetraciclinas e inhibidor de la vía del folato) con 15 aislados.

Tabla 2 Relación del número de familias antibióticas presentes en los patrones de resistencia y de cantidad de aislados de E. coli de origen bovino examinados

4. Discusión

En este estudio se detectaron altos porcentajes de resistencia antibiótica en cepas de E. colide origen bovino. Para analizar el perfil de susceptibilidad antibiótica de los aislados se utilizó el método de difusión en disco Kirby-Bauer. El 100 % de los aislados estudiados presentaron patrones de multirresistencia [MDR] a 3 o más familias antibióticas. Estudios previos han reportado altas prevalencias de MDR en países en vías de desarrollo como Pakistán, China, México y Brasil (Jalil et al., 2023; Liu et al., 2022; Martínez-Vázquez et al., 2021; Tutija et al., 2022). Las MDR obtenidas en este estudio podrían estar relacionadas al uso incorrecto de antibióticos en la crianza de los bovinos (Martínez et al., 2023).

Se observó una amplia resistencia a las cefalosporinas de tercera y cuarta generación (ceftazidima y cefepime).

La resistencia a la tetraciclina fue del 80,6 %, lo que concuerda con resultados publicados previamente en Países Bajos, Estados Unidos y México (Dorado-García et al., 2016; Hesp et al., 2019; Lee et al., 2020; Martínez-Vázquez et al., 2021). Las tetraciclinas son fármacos comúnmente utilizados para la producción de animales de consumo como profiláctico y/o como promotor del crecimiento (Alonso et al., 2017). En Ecuador se importó mayormente tetraciclina de uso veterinario en el año 2019 y no se descarta la posibilidad de que la administración de este antibiótico en la industria agropecuaria esté asociada a las farmacorresistencias (Amancha et al., 2023).

También se encontraron valores altos de resistencia para ciprofloxacina (91,4 %). Una revisión sistemática concluyó que se documenta con mayor frecuencia resistencias a betalactámicos y quinolonas en aislados bacterianos de animales de consumo (Cota-Rubio et al., 2014). En el contexto nacional, los veterinarios prescriben quinolonas de tercera y cuarta generación en granjas bovinas y avícolas (Martínez et al., 2023). Se piensa que la resistencia a quinolonas podría estar asociada con la producción de BLEE en la familia Enterobacteriaceae debido a una co-transferencia de genes (Ortega-Paredes et al., 2020). Este fenómeno podría explicar en parte la resistencia a quinolonas en E. coli BLEE encontradas en este estudio.

En el caso de la amikacina, la resistencia fue del 90,3 % en los aislados de E. coli BLEE. Se han encontrado prevalencias muy bajas de resistencia a amikacina en cerdos (0,2 %) y terneros (0,3 %) en algunos países miembros de la Unión Europea (European Food Safety Authority [EFSA], y European Centre for Disease Prevention and Control [ECDC], 2023; Organización Mundial de Sanidad Animal [OMSA], 2021). Cabe aclarar que la resistencia a amikacina en E. coli está relacionada a la presencia de enzimas modificadoras de aminoglucósidos [EMA]. Un tipo de EMA son las enzimas 16S ARN metiltransferasas (RMTasas) que pueden ser codificadas en el mismo plásmido que las enzimas tipo BLEE o AmpC (Akova, 2016; EFSA y ECDC, 2023). Por lo cual, la presencia de EMA podría resultar en la presencia de resistencias a distintos antibióticos.

Uno de los factores que podría estar incrementando las MDR en el ganado lechero es el uso de antibióticos para la salud de la ubre (Oliver y Murinda, 2012). Se ha reportado que en Ecuador se usan antibióticos como amoxicilina más ácido clavulánico, cefalexina, ceftiofur, penicilina, estreptomicina, tilosina, lincomicina y neomicina para el tratamiendo de mastitis (Jácome Mora, 2022). Además, el uso profiláctico de antibióticos es ampliamente practicado para proteger a la ubre de las mastitis subclínicas en el periodo de secado (Öney et al., 2023), lo que ha sido reportado como un factor que pueda incrementar las RAM (Dong et al., 2022; Oliver y Murinda, 2012). Todos estos factores podrían estar relacionados con los altos valores de MDR.

En el país, los estudios sobre las RAM en bovinos son limitados y por ello se necesitan más investigaciones en distintas áreas del país con el objetivo de contribuir en la implementación de medidas para una vigilancia integral y el control de la propagación de E. coli BLEE. También hay que tomar en cuenta la implementación de alternativas o la optimización del uso de antibióticos en la producción de ganado bovino de leche para controlar los altos niveles de RAM reportados en este estudio.

5. Conclusión

Se determinó que los antibióticos con mayor resistencia en aislados de E. coli BLEE de bovinos productores de leche fueron: amoxicilina más ácido clavulánico, cefepime, ceftazidima, ciprofloxacina, amikacina y tetraciclina. Se encontró que todos los aislados de E. coli BLEE presentaron patrones de multirresistencia.