Avanzar en los objetivos de la industria del cacahuete: El valor de las pruebas de aflatoxinas para fines específicos

En todas las etapas de la cadena de valor, la capacidad de infundir confianza en la seguridad y la calidad de sus productos depende con frecuencia de la solidez de los datos de las pruebas de aflatoxinas. La información sobre los niveles de aflatoxinas desempeña una función decisiva en las decisiones de gran alcance que adoptan los miembros de la industria del maní y otras partes interesadas en la inocuidad de los alimentos, desde los productores, elaboradores y fabricantes de maní hasta los laboratorios de ensayo y los organismos reguladores gubernamentales. Para garantizar la exactitud y fiabilidad de esa información, los instrumentos y procedimientos analíticos que la generen deben estar concebidos específicamente para simplificar y resolver la complejidad intrínseca de la determinación de los niveles de aflatoxinas en el maní.

Reglamento sobre las aflatoxinas: Las consecuencias económicas y para la salud pública del cumplimiento Uno de los factores clave que complica esta tarea es el rigor de las actuales reglamentaciones sobre las aflatoxinas. Los límites de partes por billón (ppb) que prevalecen en más de 100 países de todo el mundo surgieron en respuesta a pruebas científicas sustanciales de que las aflatoxinas plantean graves riesgos para la salud humana y animal. La susceptibilidad a esos riesgos es mayor entre los seres humanos y los animales muy jóvenes, desnutridos o inmunocomprometidos, y varía en los animales maduros según su especie, sexo y raza. La forma más común de aflatoxina, AFB1, es de particular preocupación. Clasificada como carcinógeno del Grupo 1 por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), la AFB1 también está relacionada con la supresión inmunológica y el daño hepático y renal. Debido a que estas toxinas pueden aparecer en cualquier materia prima o producto acabado derivado del maní -como las cáscaras, el aceite o la mantequilla de maní-, los problemas relacionados con el control de las aflatoxinas afectan a todos los segmentos de la cadena de valor de la industria del maní.

A pesar del reconocimiento internacional de la necesidad de limitar las concentraciones de aflatoxinas en los alimentos y piensos, la amplitud y el rigor de las restricciones impuestas a los productos del maní en las principales regiones productoras de maní y en los mercados de importación varían considerablemente. (Véase el cuadro 1.) Los niveles máximos permitidos para los cacahuetes destinados al consumo humano van desde el límite de la India de 30 ppb de aflatoxinas totales (la suma de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2) hasta el límite de la UE de 2 ppb de aflatoxina B1. Además de exigir los límites más bajos, los reglamentos de la UE incorporan los requisitos más detallados, prescribiendo límites separados, algo menos restrictivos, para las aflatoxinas totales, así como para los cacahuetes destinados a la elaboración.

En los Estados Unidos, la FDA mantiene un nivel de acción (AL)* de 20 ppb para las aflatoxinas totales en los cacahuetes comercializados para el consumo humano; sin embargo, la industria aplica voluntariamente un límite de 15 ppb a estos productos. Si bien en la mayoría de los países desarrollados existen normas separadas para los piensos, en las que se definen algunos límites específicos para los ingredientes derivados del maní, esas reglamentaciones son poco frecuentes en los países en desarrollo y en transición. Estas disparidades reflejan las diferencias entre las naciones en las numerosas consideraciones que se tienen en cuenta en la filosofía de la reglamentación, incluidos los recursos económicos y tecnológicos, las preocupaciones comerciales, las percepciones de riesgo y las pautas de consumo de alimentos.

Para los exportadores de las cuatro principales regiones productoras, las realidades del actual panorama del comercio internacional han elevado el listón del rendimiento de las pruebas de aflatoxinas mucho más allá de los niveles requeridos para documentar el cumplimiento de los reglamentos nacionales. Europa, que actualmente es el mayor importador de maní del mundo, así como la región comercial más estrictamente reglamentada, presenta a los exportadores un mercado sumamente atractivo y a la vez desafiante. En 2018, ese mercado alcanzó un valor de 1.600 millones de euros (euros)5 (1.731.200.000 dólares de los EE.UU.) (véase el cuadro 1), derivado principalmente de los cacahuetes vendidos como aperitivos e ingredientes alimentarios.

Los envíos de los exportadores que buscan una parte significativa de esos ingresos pueden ser seleccionados al azar para someterlos a pruebas de aflatoxinas a su llegada a la frontera del país importador. Los que superan los estrictos límites legales de la región se comunican al Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (RASFF) de la UE, una red de intercambio de información que da a conocer las violaciones de la reglamentación en todos los Estados miembros, impidiendo efectivamente su entrada en cualquier nación de la UE.

Los exportadores que se encuentran en esta situación tienen que deshacerse de la remesa que no cumple con los requisitos a sus expensas o redirigirla a un mercado con reglamentos menos exigentes. Los costos de esta última alternativa incluyen no sólo los gastos de envío, que pueden llegar a ser de hasta 4.000 dólares por contenedor, sino también la pérdida que supone la venta de los productos con un gran descuento. Los gastos de almacenamiento de la remesa rechazada mientras el exportador busca otro comprador también figuran en el recuento. Si los términos del acuerdo de reserva exigen que el exportador pague por la elaboración de los cacahuetes para reducir su contenido de aflatoxinas, la suma total aumentará en consecuencia. El hecho de que no se realicen las inspecciones puede tener también consecuencias a largo plazo. Los futuros envíos de los exportadores citados por el RASFF suelen ser objeto de un mayor escrutinio por parte de los organismos reguladores y pueden ser considerados de manera negativa por los compradores. Las consecuencias del incumplimiento de las normas también recaen en el lado de la importación, ya que los compradores se ven obligados a buscar un nuevo proveedor.

En este ámbito comercial de alto riesgo, una posición sólida en el mercado requiere un enfoque normalizado de los ensayos previos a la exportación que reduzca los límites de la detección y la medición y aumente al mismo tiempo el nivel de certidumbre que se atribuye a los resultados.

Para satisfacer esos requisitos, el proceso de prueba debe tener en cuenta no sólo los desafíos del análisis de ultratrazas, sino también las complicaciones que presenta la composición de la muestra de prueba. Los cacahuetes comprenden una variedad de sustancias, como proteínas y aceites, que pueden interferir en la exactitud de la prueba, aumentando las posibilidades de obtener falsos positivos y falsos negativos. Las muestras de ensayo que consisten en materiales que se seleccionaron o prepararon incorrectamente tienen aún más probabilidades de producir sobreestimaciones y subestimaciones de los niveles de aflatoxinas.

El importante potencial de error que surge de estas complejidades de ensayo entraña riesgos igualmente importantes para los compradores y los vendedores de todos los sectores de la industria del maní:

Los esfuerzos por limitar estos riesgos figuran de manera prominente en el proceso aprobado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de clasificar los lotes de maní destinados a la venta en los Estados Unidos. Este proceso metódico, de principio a fin, entraña la toma de muestras de lotes de maní en puntos designados de la cadena de producción a fin de examinarlos en laboratorios aprobados por el Departamento de Agricultura para determinar si cumplen los límites de aflatoxinas establecidos por la industria. Las normas del USDA especifican tres opciones posibles para los lotes que no cumplen con las normas:

(1) Pueden ser destruidos; (2) reacondicionados a expensas del propietario para reducir el contenido de aflatoxinas a un nivel aceptable; o (3) restringidos a la fabricación de aceite, ingredientes de piensos y materiales industriales, excluyéndolos de la producción mucho más rentable de artículos alimenticios como los cacahuetes para aperitivos y la mantequilla de cacahuete.

Para asegurar la integridad del proceso de prueba que determina el estado de cumplimiento de los productos de maní, el USDA establece estrictos requisitos para los laboratorios que participan en su programa de pruebas de aflatoxinas. El principal de ellos es el uso de métodos de prueba y protocolos de muestreo aprobados por el USDA.

Uno de los métodos de prueba más utilizados de los aprobados es el método oficial 991.31 de la AOAC.

El método oficial 991.31 de la AOAC es una aplicación del inmunoensayo AflaTest que su promotor, VICAM, A Waters Business, adaptó específicamente a los retos de estimar con precisión y fiabilidad la concentración de aflatoxinas de los productos de cacahuete. Fruto de la colaboración entre el equipo científico de la empresa y la AOAC International, este método oficial de análisis refleja los más altos niveles de excelencia técnica. La AOAC, organización científica independiente y sin fines de lucro dedicada a fomentar la "confianza mundial en los resultados analíticos", reserva la designación de "Método Oficial" para los métodos de ensayo que han sido ampliamente examinados por expertos imparciales en química analítica. Una vez que un laboratorio independiente confirma que las características de rendimiento del método satisfacen las exigencias de su finalidad prevista, la AOAC lleva a cabo un estudio en colaboración para verificar que el método ofrece resultados coherentes en toda una gama de diferentes condiciones de laboratorio. Este riguroso proceso de validación por terceros ofrece a los interesados de la industria del cacahuete la firme seguridad de que los datos sobre aflatoxinas obtenidos con el método AflaTest ofrecen el grado de certidumbre necesario para su utilización en la adopción de decisiones de gran trascendencia.

Los resultados de las pruebas científicamente sólidos y procesables son el eje de los resultados de la vigilancia de las aflatoxinas que benefician por igual a los compradores y vendedores nacionales, los exportadores, los importadores y los consumidores:

El método AflaTest de VICAM, aprobado por la AOAC, combina las columnas de inmunoafinidad (IA) de alto rendimiento de la empresa con la tecnología de detección de fluorescencia que aprovecha la fluorescencia natural de las micotoxinas para detectar y medir las aflatoxinas a niveles tan bajos como 2 ppb. El instrumento de detección emparejado con las columnas puede adoptar la forma de un fluorómetro portátil o un sistema de HPLC con un detector de fluorescencia. La versión fluorométrica del método no requiere ninguna capacitación especial para obtener resultados precisos en menos de 15 minutos.

Su facilidad de uso y su asequibilidad hacen de esta versión una opción práctica para los laboratorios con recursos limitados, así como para los inspectores de control de calidad internos que necesitan un acceso rápido in situ a datos fiables de apoyo a las decisiones. La adopción generalizada de la versión de HPLC en los laboratorios de referencia europeos la define como el método de elección para lograr niveles de sensibilidad y precisión que satisfagan los criterios de rendimiento establecidos por las autoridades europeas.

El gerente de ventas globales de la compañía, Lanny Smith, llama a AflaTest el estándar de oro para las pruebas de la industria del maní. "Ofrece un sistema de seguridad a gran escala que va desde una rápida y precisa prueba fluorométrica en todos los puntos de control críticos hasta un análisis HPLC definitivo de los niveles de aflatoxinas en los productos básicos destinados a los mercados más estrictamente regulados".

Las columnas IA de AflaTest ayudan a minimizar la incertidumbre que conlleva el análisis de aflatoxinas optimizando la limpieza de las muestras. Las perlas estacionarias dentro de la columna son tratadas con anticuerpos monoclonales* ultra sensibles y selectivos que se unen fuertemente con las aflatoxinas de la muestra, inmovilizándolas para que las impurezas de la matriz puedan ser lavadas con agua. Para completar el proceso, el usuario añade metanol a la columna para separar las aflatoxinas de los anticuerpos, recoge el eluido y lo mezcla con agua. Las altas tasas de recuperación que se logran con este método, así como su eficacia en la eliminación de los componentes de la matriz que podrían interactuar con los anticuerpos de la columna, reducen al mínimo el riesgo de resultados de pruebas falsos positivos y falsos negativos. No se requieren medidas adicionales para garantizar la pureza de la muestra. La sencillez de este método de limpieza disminuye el potencial de error humano y promueve un flujo de trabajo rápido, manteniendo al mismo tiempo la calidad de los resultados de las pruebas.

El desarrollo de la tecnología de anticuerpos monoclonales en los años 70 es ampliamente reconocido como un hito en el progreso científico hacia una cada vez más sensible y pruebas de diagnóstico específicas. Diseñados en laboratorios, los anticuerpos monoclonales (MAbs) sólo pueden unirse a un solo sitio en el antígeno de interés. Esta característica de los MAbs optimiza su utilidad para la detección y purificación de los analitos de interés, convirtiéndolos en poderosas herramientas para identificar y aislando proteínas, hormonas, toxinas y otras moléculas de interés para una amplia gama de científicos de laboratorio, incluidos los investigadores biomédicos, desarrolladores de drogas, toxicólogos y químicos analíticos. En 1986, VICAM obtuvo una de las primeras patentes para el uso de anticuerpos monoclonales en un kit de prueba de aflatoxinas, marcando el desarrollo de su buque insignia, el inmunoensayo AflaTest, como una innovación significativa.

Para obtener todo el valor del método aprobado por la AOAC, los usuarios deben tener cuidado de observar los protocolos prescritos. Los atajos y las soluciones provisionales, como saltarse pasos o reutilizar las columnas u otros elementos de uso único, pueden comprometer la exactitud, la precisión y la repetibilidad de los resultados de la prueba.

Un aspecto de las pruebas que justifica una atención particular a esta advertencia es la recolección y el procesamiento de materiales de muestra. El programa de certificación del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos requiere el uso de muestras representativas y técnicas adecuadas de preparación de muestras. La integración de estas mejores prácticas en el proceso de prueba es esencial para lograr resultados óptimos con el método AflaTest. Desviarse de los protocolos aprobados es establecer todo el proceso para el fracaso. Un estudio histórico realizado por el experto en muestreo de renombre internacional Thomas Whitaker cuantificó este riesgo: Más del 80 por ciento de la variabilidad de las pruebas de aflatoxinas se debe a errores en el proceso de creación de las muestras de prueba10.

Nancy Zabe Collette, Gerente de Servicios Técnicos y Aplicaciones de VICAM, subrayó que el éxito de las pruebas comienza con la plena conciencia de que los niveles de aflatoxinas pueden variar enormemente entre las diferentes muestras del mismo lote. Esta variabilidad refleja la tendencia de las aflatoxinas a ocurrir en "puntos calientes" aislados. En la práctica, este patrón de distribución significa que la cantidad total de aflatoxina de un lote de 20 toneladas métricas puede limitarse a uno o dos granos de maní. Esa cantidad puede ser considerable, y puede llegar a varios cientos de miles a 1 millón de ppb11 . Por consiguiente, el muestreo de sólo unas pocas zonas pequeñas de un lote podría dar lugar a estimaciones muy sesgadas de su contenido de aflatoxinas.

"Para obtener una imagen exacta del lote", explicó Collette, "necesitas obtener tu muestra de prueba de una gran muestra agregada que ha sido molida y mezclada para que cualquier material contaminado se esparza uniformemente a través de la submuestra". En los lotes estáticos, la muestra agregada debe ser ensamblada recogiendo múltiples muestras incrementales de todas las áreas del lote, usando una sonda manual o mecánica que se extiende de arriba a abajo para dibujar una sección transversal representativa de los granos. Se debería utilizar un muestreador de tipo desviador para tomar muestras incrementales a intervalos regulares de una corriente en movimiento. Todos los procedimientos y el equipo utilizados deberían promover el muestreo aleatorio para garantizar un proceso de ensayo imparcial.

En el documento "Good Manufacturing Practices and Industry Best Practice for Peanut Manufacturers", el Consejo Americano del Cacahuete recomienda los "Sampling Methods to Measure and Grade Factors of Peanuts" de Thomas Whitaker como fuente autorizada de información detallada sobre el muestreo representativo, incluido el equipo adecuado, los pesos de las muestras y los patrones de las sondas.

Preparación: La etapa inicial de la limpieza de la columna de AflaTest requiere la combinación de una muestra molida de 25 gramos y 5 gramos de sal con una solución de metanol:agua en una licuadora y la mezcla a alta velocidad durante 2 minutos. En las directrices del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos para los laboratorios de certificación se hace hincapié en la importancia de reducir al mínimo el tamaño de las partículas de los granos con un molino de molienda adecuado, como un molino de corte vertical (VCM), y de homogeneizar minuciosamente la mezcla de la muestra para asegurar que las aflatoxinas presentes se distribuyan uniformemente por toda la muestra. La muestra extraída se filtra y diluye y luego se vuelve a filtrar para eliminar las partículas insolubles que podrían interferir en el rendimiento de la HPLC y dañar los componentes del sistema. El usuario debe realizar el procedimiento de cromatografía inmediatamente después de recoger el filtrado de la segunda filtración en el barril de jeringa de vidrio que servirá de depósito de la muestra para la columna. El procedimiento se describe en el siguiente diagrama.

Nota: La atención cuidadosa a las instrucciones en cada fase de la prueba es un requisito fundamental para un proceso sin problemas y un resultado exitoso. Este requisito incluye el uso del equipo y los reactivos recomendados (es decir, metanol de calidad CLAR y agua purificada, desionizada o destilada). Cada uno de los elementos recomendados ofrece ventajas de rendimiento.

Por ejemplo, el papel de filtro acanalado y un filtro de microfibra optimizan la recuperación de aflatoxinas y promueven la eliminación eficiente de las partículas que podrían bloquear la columna de HPLC y causar picos innecesarios en los datos. Asimismo, el uso de reactivos de alta pureza ayuda a asegurar un rendimiento ininterrumpido de la HPLC y resultados precisos de las pruebas. La atención a la limpieza del equipo es igualmente vital. Dado que la fluorescencia de fondo del equipo contaminado puede afectar a los resultados de las pruebas, todos los materiales y equipos de prueba deben mantenerse libres de polvo, huellas dactilares, fibras y otros contaminantes autofluorescentes. El uso de una cubeta VICAM fresca para recolectar el efluente también es esencial. Las cubetas desechables nunca deben ser lavadas o reutilizadas.

Purificación: Para purificar y concentrar el extracto filtrado y diluido para el análisis HPLC, el usuario pasa una porción de 15 mL a través de la columna AflaTest. El extracto se introduce en la columna desde un barril de jeringa unido a un soporte de bomba aplicando la presión de aire de una bomba de acuario. La columna se lava con agua y se eluye con metanol. El usuario debe tener cuidado de mantener el flujo adecuado durante estos pasos para optimizar la eficiencia de la extracción. El siguiente diagrama describe el procedimiento.

VICAM proporciona detalles adicionales sobre el uso adecuado de las columnas de AflaTest en su Manual de Instrucciones de HPLC de AflaTest, incluyendo información sobre la preparación de las soluciones de extracción, la vida útil, las condiciones de almacenamiento, el montaje del soporte de la bomba y la configuración de HPLC. El manual de instrucciones del método fluorométrico AflaTest, validado por la AOAC del VICAM, proporciona un nivel de detalle similar, incluyendo instrucciones paso a paso para calibrar el fluorómetro. La inversión de la empresa en la educación de los clientes se extiende a la capacitación de los productos y equipos en el lugar, así como al acceso telefónico a un equipo de servicios técnicos expertos dedicados a guiar a los clientes a través de los pasos para obtener resultados óptimos en las pruebas. La recompensa es la garantía de que los clientes de la industria del maní de VICAM pueden confiar en el método AflaTest para obtener respuestas creíbles y verificables en todo momento.