La etoxiquina modifica los efectos bioquímicos e histopatológicos de la intoxicación crónica por aflatoxinas en gallinas de postura

INTRODUCCIÓN

Las micotoxinas producen un fuerte impacto en la salud humana y animal y se estima que las mismas ocasionan importantes pérdidas económicas valuadas en millones de dólares. En la industria avícola, las aflatoxinas representan un serio problema ya que frecuentemente se les ha relacionado con la contaminación de los alimentos debido a sus propiedades tóxicas y carcinogénicas. Los efectos tóxicos más importantes que éstas producen en las aves es la mortalidad cuando se consumen niveles muy altos, pero cuando los niveles van de moderados a bajos y de manera crónica, ocasionan una reducción de la productividad debido al daño producido principalmente a nivel hepático, renal e inmunológico (11).

En gallinas de postura, se ha demostrado que las aflatoxinas inducen una disminución de la cantidad y calidad en el huevo producido (31), y aunque el organismo del animal logra inactivar una buena parte de la aflatoxina incluida en los granos, cuando las dosis de éstas son altas, los niveles de contaminación en el huevo rebasan los límites de detección y los límites máximos de tolerancia (43). Durante los últimos años, varias investigaciones se han centrado en componentes no nutricionales contenidos en la dieta (7, 13, 35) que ayuden a prevenir, disminuir o inactivar el efecto de las aflatoxinas. Se ha demostrado que la quimioprotección puede prevenir, inhibir o revertir el efecto patológico ocasionado por algunos agentes tóxicos, como es el caso de las aflatoxinas (22). La etoxiquina es un compuesto sintético empleado para proteger sustancias lipídicas y preservar carotenos y vitaminas A y E, además previene la combustión espontánea de productos almacenados al inhibir el calor producido por la oxidación de lípidos (3, 40). En la avicultura se usa para inhibir la oxidación de lípidos y compuestos liposolubles en el alimento y así mejorar la estabilidad de la grasa y proteínas en el pollo de engorda (26); la prevención de la oxidación de compuestos nutricionales se vuelve importante para que exista un crecimiento y desarrollo óptimos, ya que el incremento del consumo de peróxidos puede causar una disminución de crecimiento y un efecto negativo en la eficiencia alimenticia (40). Con base en lo anterior, se ha planteado que el uso de agentes quimioprotectores, como la etoxiquina, adicionados en la dieta puede prevenir o atenuar los efectos tóxicos sobre los parámetros bioquímicos y patológicos ocasionados por la intoxicación crónica alimentaria con aflatoxinas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se adquirieron 240 gallinas de postura Hy- Line W36 de un día de edad, con semejanza de peso corporal (media ± 5.0 %) y ausencia de defectos morfológicos. Las aves fueron criadas bajo procedimientos zootécnicos estándar (16); el agua y alimento fueron suministrados ad libitum desde el primer día hasta la semana 85 de edad. Para la etapa de crianza las aves fueron alojadas en jaulas en batería con calefacción manual y para la etapa de desarrollo y producción se utilizaron jaulas invertidas en pirámide de dos pisos. El manejo de las aves y de las instalaciones fueron mantenidas dentro de las recomendaciones de la Federation of Animal Science Societies (5). La dieta base fue elaborada de acuerdo a los requerimientos nutricionales señalados por la National Research Council (27), no se añadieron coccidiostatos, antibióticos ni promotores del crecimiento.

Las aflatoxinas se obtuvieron mediante la contaminación de maíz con utilizando dos cepas toxicogénicas de Aspergillus flavus (39). La dieta base y el maíz contaminado se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución para cuantificar la concentración de micotoxinas de acuerdo al método señalado por la AOAC (método 990.33) (34).

Las aves fueron anestesiadas (25 mg/kg de pc de pentobarbital sódico vía IV) hasta que alcanzaron un plano quirúrgico para luego realizar una perfusión in situ. El hígado y los riñones fueron pesados, además se obtuvieron muestras de ambos órganos y se conservaron en una solución fijadora (formalina neutra al 10%) hasta que se les realizó la técnica histológica con hematoxilina y eosina (28). También se obtuvieron muestras de dichos órganos para cuantificar la concentración de glutatión reducido (14), para determinar la actividad enzimática de las transferasas de glutatión (10) y de gamma glutamiltranspeptidasa (4, 17).

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con un análisis estadístico con arreglo factorial de tratamientos (36), comparando dos niveles del quimioprotector (0.00 y 500 mg/kg de alimento) contra cuatro niveles de aflatoxinas (0.00, 0.50, 1.00 y 1.50 mg/kg de alimento). Para la evaluación de los parámetros bioquímicos y patológicos se realizaron cinco muestreos que correspondientes a un día de edad (día cero), 27 semanas de edad (14 semanas de intoxicación), 31 semanas de edad (20 semanas de intoxicación), 59 semanas de edad (46 semanas de intoxicación) y 85 semanas de edad (72 semanas de intoxicación) de las gallinas. La comparación de medias de los tratamientos se realizó por medio de la prueba protegida de Fischer, considerando un nivel de probabilidad P < 0.05. Los datos de todas las variables fueron sometidos a un análisis de varianza mediante el procedimiento para modelos lineares generales del software Statistical Analysis System (33).

RESULTADOS

En el análisis microscópico del hígado y riñón de las gallinas que no consumieron aflatoxinas, mostró un arreglo estructural característico de ambos órganos. Con la metodología utilizada, no se detectaron diferencias en el grado de daño a la estructura celular atribuible a las diferentes dosis de las aflatoxinas ni tampoco al empleo del quimioprotector combinado con las mismas. La principal alteración en el caso del hígado fue la degeneración grasa microvesicular y macrovesicular, focos necróticos en hígado y riñón de las gallinas intoxicadas, focos de infiltración linfocitaria y amiloidosis en la periferia de vasos sanguíneos y en el espacio perisinusoidal. En el caso del riñón, también se observaron focos de infiltración linfocitaria entre los glomérulos y túbulos renales así como amiloidosis en vasos sanguíneos en el área mesangial de los glomérulos y alrededor de los túbulos.

En las aves intoxicadas con aflatoxinas se observó un descenso en la concentración de glutatión reducido hepático, principalmente en las dosis más elevadas y al final de la fase experimental (Figura No. 1).

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FIGURA No. 1. Efecto del tratamiento con aflatoxinas y etoxiquina sobre la concentración de glutatión reducido en hígado y riñón. Los asteriscos (**) indican diferencias significativas (P< 0.01) a la prueba de rango de amplitud múltiple de Duncan

En lo que respecta al glutatión reducido renal, todos los grupos de tratamiento mostraron un descenso en la semana 72 de intoxicación; aunque las aves intoxicadas y tratadas con etoxiquina tuvieron una concentración de glutatión reducido similar al del grupo control, hubo diferencias significativas (P< 0.01) en la semana 46 de intoxicación. En cuanto a las transferasas de glutatión durante las primeras 20 semanas de tratamiento, se produjo una actividad enzimática irregular en hígado y riñón, pero posteriormente se observó una estabilización de los efectos de las aflatoxinas y de etoxiquina destacando una disminución significativa (P< 0.01) en las semanas 46 y 72 de intoxicación (Figura No. 2).

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FIGURA No. 2. Efecto del tratamiento con aflatoxinas y etoxiquina sobre la actividad de las transferasas de glutatión en hígado y riñón. Los asteriscos (**) indican diferencias significativas (P< 0.01) a la prueba de rango de amplitud múltiple de Duncan

La actividad de las transferasas de glutatión hepáticas de las aves intoxicadas disminuyó significativamente (P< 0.01) al final del estudio en las dosis más elevadas de aflatoxinas con referencia al grupo control. Sin embargo, el incremento de la actividad enzimático producido en las dosis más baja, entre las semanas 46 y 72, coincide con la depleción de glutatión reducido en este mismo órgano durante el mismo periodo. Este mismo efecto se observó en el caso de la actividad de las transferasas de glutatión a nivel de riñón, aunque hubo una actividad más elevada que el grupo control.

La actividad de la gamma glutamiltranspeptidasa en hígado se incrementó significativamente (P< 0.01) en las gallinas intoxicadas con las dosis elevadas (1.0 y 1.5 mg/kg) durante la semana 20 de intoxicación y con referencia a las gallinas control (0.0 mg/kg). Con el transcurso del tiempo, la actividad fue descendiendo significativamente (P< 0.01) hasta el final del estudio en las gallinas que recibieron las tres dosis de aflatoxinas (Figura No. 3).

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FIGURA No. 3. Efecto del tratamiento con aflatoxinas y etoxiquina sobre la actividad de gamma glutamiltranspeptidasa en hígado y riñón. Los asteriscos (**) indican diferencias significativas (P< 0.01) a la prueba de rango de amplitud múltiple de Duncan

La actividad de la enzima mostró una tendencia más estable durante toda la fase experimental en el grupo etoxiquina con algunas variaciones significativas (P< 0.01). A diferencia de lo ocurrido en hígado, la actividad de la enzima en riñón fue menor y con un comportamiento regular durante toda la fase experimental con algunas variaciones significativas (P< 0.01), principalmente durante las primeras 20 semanas de intoxicación.

DISCUSIÓN

La degeneración grasa en hígado que se observó en los grupos intoxicados con aflatoxinas en este estudio, se debe a que éste es el principal órgano en el cual se lleva a cabo la síntesis de ácidos grasos (1, 6, 38). Se ha indicado que el consumo de aflatoxina B1 produce daño en los genes que sintetizan enzimas que metabolizan ácidos grasos, ocasionando una disminución en la actividad de las mismas y en el transporte de lípidos, originando un aumento en la concentración de lípidos y el peso relativo del hígado (30, 37, 42), ocurriendo principalmente en exposiciones crónicas (15). La presencia de células inflamatorias en áreas dañadas del hígado y riñón, específicamente en zonas perivasculares, debido al consumo de aflatoxinas, es una respuesta inflamatoria que puede estar involucrada en un proceso regenerativo de células parenquimatosas y no parenquimatosas, espectivamente (18, 21); mientras que la amiloidosis también se ha indicado que se produce como una respuesta secundaria a enfermedad crónica o procesos destructivos de tejido (25). La degeneración epitelial y la falta del borde en cepillo en los túbulos contorneados proximales del riñón se ha relacionado a necrosis tubular aguda ocasionados por este tipo de micotoxinas. Los cambios producidos en la estructura renal, tales como el incremento en el espacio de la cápsula de Bowman y en la morfometría glomerular (23, 38), ocasionan una falla en el funcionamiento renal, dependiendo de la dosis y duración de la exposición al xenobiótico (8, 21, 32).

Los niveles de glutatión reducido hepático y renal de las aves intoxicadas tratadas con etoxiquina, posiblemente no se incrementaron debido a la función antioxidante del compuesto. Sin embargo, las variaciones observadas en hígado, se interpreta como una menor producción de epóxidos de aflatoxina y que no requirió de manera importante la utilización de la ruta metabólica de formación de ácido mercaptúrico. En presencia de aflatoxinas, el nivel de glutatión reducido hepático disminuye debido a que es el principal órgano blanco (38), además de que sus niveles son más elevados comparado con los riñones (24, 29), los cuales reciben un menor porcentaje de la aflatoxina absorbida, ejerciendo el mismo efecto sobre la concentración de glutatión reducido presente en este órgano. En las aves intoxicadas, el glutatión reducido renal descendió tal vez porque sus niveles no son tan elevados como los que presenta el hígado, por lo que fue insuficiente para formar conjugados con los epóxidos de aflatoxinas; sin embargo, se ha reportado que la depleción de los niveles de glutatión reducido por este tipo de agentes tóxicos produce consecuencias celulares que culminan con la destrucción de la célula y falla del órgano afectado (19). Aunque la etoxiquina no confirió protección en las gallinas intoxicadas sobre este parámetro a nivel de hígado y riñón, estudios en ratas han demostrado que este quimioprotector es capaz de inducir la formación de conjugados que epóxidos con glutatión reducido hepático (12). En aves, los efectos quimioprotectores de etoxiquina contra aflatoxinas son poco conocidos.

El incremento de la actividad de la gamma glutamiltranspeptidasa en hígado de las gallinas intoxicadas puede interpretarse como una respuesta del organismo para sintetizar esta enzima ante la presencia de conjugados de epóxidos de aflatoxina con glutatión reducido. El descenso de la actividad al final del estudio puede relacionarse a un efecto de consumo de la enzima al participar en la eliminación de los conjugados por la vía del ácido mercaptúrico. Mientras que la estabilidad de la actividad enzimática en las aves intoxicadas y tratadas con etoxiquina, probablemente se produjo porque se el quimioprotector evitó la formación de epóxidos, reduciendo así la utilización de la vía del ácido mercaptúrico, debido a su efecto antioxidante. La actividad disminuida y estable de la gamma glutamiltranspeptidasa en riñón de las gallinas intoxicadas durante las primeras semanas de la fase experimental, pudo deberse a que el hígado es el principal órgano encargado de metabolizar las aflatoxinas, mientras que los riñones tienen un porcentaje menor de participación. Sin embargo, en las aves intoxicadas tratadas con etoxiquina, este compuesto ejerció sus propiedades antioxidantes, pues el incremento de la actividad que se presentó, posiblemente se debió a un menor porcentaje de aflatoxinas que logró llegar al riñón, observándose un efecto crónico al final del experimento, donde el grado de actividad enzimática fue proporcional a la dosis de aflatoxinas, suponiendo que tal vez la única dosis del quimioprotector que fue suministrada, se saturó conforme se incrementó la dosis de la micotoxina. Estudios en ratas, han indicado que el riñón juega un papel muy importante en la eliminación de este tipo de xenobióticos por filtración vía glomerular, debido a que presentan una elevada actividad enzimática de la gamma glutamiltranspeptidasa y niveles altos de glutatión reducido (9, 41). Se sabe poco del efecto de etoxiquina sobre la actividad de lagamma glutamiltranspeptidasa en pollos intoxicados con aflatoxinas. Pero algunos autores reportaron la eficacia de la etoxiquina en pollos alimentados con dietas que contenían grasas oxidadas, donde los resultados obtenidos indicaron concentraciones elevadas de glutatión reducido y gamma glutamiltranspeptidasa a nivel intestinal, donde la etoxiquina se encargó de transportar glutatión reducido a las células intestinales y por tantoincrementar la actividad enzimática contra toxinas presentes en ellos (2, 20).