Evaluación de la presencia de las micotoxinas zearalenona y aflatoxina total en arroz sin cáscara en las provincias de mayor producción de Ecuador

La agricultura constituye una de las actividades primarias de mayor importancia en la economía ecuatoriana, debido a la privilegiada ubicación geográfica de este país, que permite producir una amplia gama de productos permanentes y estacionales. Los cultivos estacionales se caracterizan por un ciclo de crecimiento menor a un año, incluso puede ser de pocos meses, y que posterior a la cosecha se inicia un nuevo ciclo con la siembra. En Ecuador, estos cultivos representan el 15,76 % de la superficie de labor agropecuaria, entre estos destacan los cultivos estacionales de mayor producción: arroz, maíz duro seco y papa (INEC, 2016).

El arroz es considerado uno de los cereales más consumidos en el mundo (Gadal et al., 2019). En el ámbito ecuatoriano, el consumo per cápita ha incrementado desde el año 2000, pasando de 42 kg por persona a 53,2 kg por persona en el año 2013. Por tanto, el arroz ha llegado a constituirse como el principal componente de la canasta básica y un producto esencial dentro de la dieta diaria de los ecuatorianos (MAGAP, 2013). La disponibilidad del producto en el país se basa en la producción interna de arroz, y predominan variedades desarrolladas por el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias–INIAP. Se reportó una producción de 1534537 t en el año 2016, con la mayor producción en la región costa con 99,55 % del total, mientras que en las regiones oriental y sierra los porcentajes fueron 0,26 y 0,19 %, respectivamente (INEC, 2016).

Por otro lado, la producción de arroz en Ecuador se ha visto afectada por algunos problemas fitosanitarios tales como: la presencia de ciertos insectos, por ejemplo, la Sogata (Tagosodesorizicolus) que es el vector delvirus de la hoja blanca; la mosquilla o mosca (Hydrellia spp.) que ataca al cultivo en la etapa inicial de su crecimiento (almácigo), y el gusano rojo (Chironomidae) que afecta a las raíces de la planta (Nakandakari, 2017). El principal nematodo fitoparásito que ataca los cultivos de arroz y que ocasiona la descomposición de la raíz es Meloidogyne graminícola (Pérez et al., 2018). En Ecuador se presentan problemas por hongos en arroz; entre los que destacan organismos del género Rhizoctonia que ocasionan las enfermedades del tizón y la pudrición de la vaina en la planta de arroz (Vivas e Intriago, 2012).

Asimismo, también existen problemas asociados a microorganismos alterantes, los cuales pueden contaminar los granos de arroz durante las etapas de postcosecha, almacenamiento, transporte y el procesado. La contaminación por hongos es una problemática mundial, ya que éstos se desarrollan en los cereales cuando existen las condiciones favorables de temperatura y humedad; Lee y Ryu (2016) estimaron que entre el 29 y 61%  de los cereales sin procesar pueden estar contaminados con una o varias micotoxinas provenientes de ciertas especies de hongos filamentosos.

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, por sus siglas en inglés) ha determinado que más del 25% de los alimentos en el mundo presenta un cierto grado de contaminación con micotoxinas (FAO, 2004) e incluso esta cifra podría estar muy subestimada según estudios recientes (Eskola et al., 2020).

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos de distintos géneros y especies; necesarias para el crecimiento del hongo en cultivo puro, y por tal razón, se pueden formar al final de la fase exponencial o al inicio de la fase estacionaria de su desarrollo (Peraica et al., 2000; Duarte y Villamil, 2006). La producción de micotoxinas depende de la especie de hongo, así como del alimento y las condiciones ambientales. Por ejemplo, algunas especies de Aspergillus spp. producen aflatoxinas en cereales, maíz, arroz, frutos secos, semillas, legumbres, pasas y vino, mientras que algunas especies de Fusarium spp. son productoras de tricotecenos, fumonisinas y zearalenona en cereales (García, 2008).

Uno de los puntos críticos a considerar sobre la problemática de la contaminación por micotoxinas en el arroz es el almacenamiento, ya que, si no existen los controles adecuados, se generan las condiciones ideales para el desarrollo de los hongos productores de micotoxinas (Troestch y Vega, 2019). Aspergillus flavus, la especie más relacionada con la producción de aflatoxina requiere de determinadas condiciones para su crecimiento y generación de aflatoxinas. En el arroz, este hongo puede crecer a una temperatura entre 6 °C y 45 °C con un óptimo a 37 °C y una actividad de agua (a_w) de 0,82 (Parra et al., 2018; Tai et al., 2020). Por tales razones, Troestch y Vega (2019) recomiendan utilizar silos industrializados para tener un monitoreo cuidadoso de la temperatura y humedad del grano almacenado y así disminuir el riesgo de proliferación de los hongos productores de micotoxinas. Sin embargo, en lugares donde el almacenamiento del arroz ocurre de una forma artesanal, no existe un control apropiado de la temperatura y humedad de este alimento, e incluso los riesgos de contaminación por este hongo aumentan cuando los granos entran en contacto con el suelo.

Las micotoxinas mencionadas anteriormente se pueden presentar con mucha frecuencia en alimentos de consumo diario y la generación de estos contaminantes es mayor en zonas con climas cálidos y húmedos, en donde se producen mayoritariamente arroz (Solis, 2018). Además, existen reportes de que las micotoxinas son causantes de afectaciones fisiológicas en humanos, inclusive se las relaciona con el cáncer, por ejemplo, a la zearealenona se ha vinculado con el cáncer de mama (Claeys et al., 2020) y, por lo tanto, las poblaciones cuya dieta consta fundamentalmente de cereales y granos, están en alto riesgo de exposición a alimentos contaminados con micotoxinas y de presentar problemas de salud.

Debido a esta alta probabilidad de contaminación de alimentos por micotoxinas, es importante realizar monitoreos continuos de los productos para prevenir principalmente la exposición de los consumidores a estos contaminantes. En la actualidad, existen diversas técnicas analíticas, siendo comunes la aplicación de métodos tipo cribado o screening y confirmatorios.

La técnica ELISA (del inglés “EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay”) es unanálisis que se emplea para la determinación rutinaria de múltiples analitos incluyendo una gran variedad de micotoxinas en diversas matrices (Nolan et al., 2019). Además, esta técnica presenta varias ventajas como el bajo costo de equipos lectores de ELISA, la rapidez de los ensayos, facilidad de operación, sensibilidad analítica y la capacidad de procesamiento de un elevado número de muestras en corto tiempo, con respecto a otras técnicas tales como cromatografía de fluorescencia con derivatización y la cromatografía acoplada a espectrometría de masas (García, 2016).

Los ensayos ELISA presentan variantes como los directos, indirectos, “sandwich”, competitivos entre otros. El ensayo ELISA competitivo es el más utilizado para la cuantificación de moléculas de bajo peso molecular como las micotoxinas (antígeno); en este método el antígeno de la muestra y el antígeno fijado en una placa compiten por un anticuerpo específico. Estas interacciones posteriormente se evidencian espectrofotométricamente y se define si una muestra es positiva (sin o poco color) o negativa (coloreada) a la micotoxina, e incluso permite su cuantificación aproximada (Jordan, 2005).

En este contexto, el objetivo principal de esta investigación fue el de evaluar la presencia de las micotoxinas en muestras de arroz sin cáscara de las zonas de mayor producción de Ecuador mediante el ensayo inmunológico ELISA competitivo.

 

Con base a datos del Instituto Nacional de Estadística y Censos (INEC), la toma de las muestras se realizó en los cantones con mayor producción de arroz en las provincias de Los Ríos, Manabí y Guayas. Un total de 41 muestras, con un peso de 1 kg cada una, se obtuvieron de los silos de cada piladora mediante el protocolo establecido por la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario de Ecuador, (AGROCALIDAD), el cual se basa en los requisitos de la norma NTE INENISO 24333 referente a la toma de muestras de cereales y productos derivados (INEN, 2014). Las muestras se recolectaron y empacaron en fundas plásticas de polietileno con cierre hermético, se colocaron en un recipiente aislante con geles refrigerantes, y se enviaron a las instalaciones de los laboratorios de AGROCALIDAD ubicado en TumbacoQuito para su posterior procesamiento y determinación de aflatoxinas totales y zearalenona mediante ensayos ELISA.

5 g de arroz fueron molidos y colocados en un tubo de centrífuga. Se añadieron 25 mL de metanol al 70 % (v/v), el tubo se agitó por 20 min y luego se centrifugó (Eppendorf, modelo 5804R) a 4000 rpm durante 10 min. Se realizó una dilución de 1 mL del sobrenadante con 1 mL de agua destilada, se mezcló por agitación durante 1 min y luego se usaron 50 μL de esta mezcla para el procedimiento de inmunoensayo enzimático competitivo ELISA (BIOO Scientific, 2015).

Para la determinación semicuantitativa de zearalenona se utilizó el kit comercial ELISA BiooScientific de zearalenona (ZON) con número de referencia 103501 y se siguió el procedimiento detallado en el manual del kit (BIOO Scientific, 2015). Los parámetros de desempeño reportados del método son: recuperación > 80 % y sensibilidad de 0,1 ng/g (ppb). 

La curva de calibración se construyó con los estándares de concentraciones 0,1; 0,25; 0,5; 1,5 y 4,5 ng/mL, y además se preparó un control negativo sin la presencia del estándar. Se colocaron 50 μL de cada estándar en orden creciente en cada pocillo, por duplicado. Luego, se colocaron 50 μL de los sobrenadantes diluidos de cada muestra de arroz, y se añadieron 100 μL del mix de anticuerpos para zearalenona. Las mezclas se agitaron por 1 min. Los pocillos se incubaron durante 30 min a 25 ºC en oscuridad, y, luego las soluciones de los pocillos se desecharon. Los pocillos se lavaron 3 veces con 300 μL de solución de lavado 1X, posteriormente se agregaron 100 μL de sustrato TMB y se llevó a incubación por 15 min a 25 °C.

Después se adicionaron 100 μL de la solución amortiguadora stop para detener la reacción enzimática. Los pocillos de la placa fueron medidos en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm.

Para la determinación semicuantitativa de aflatoxina total, se utilizó el kit comercial ELISA BiooScientific de aflatoxina total con número de referencia 103002 y se siguió el procedimiento detallado en el manual del kit (BIOO Scientific, 2016). Los parámetros de desempeño reportados del método son: recuperación > 80 % y sensibilidad de 0,05 ng/g.

La curva de calibración se construyó con los estándares de concentraciones 0,02; 0,06; 0,2; 0,6 y 1,5 ng/mL y además se preparó un control negativo sin la presencia del estándar. Se colocaron 50 μL de cada estándar en orden creciente en cada pocillo, por duplicado. Luego, se colocaron 50 μL de los sobrenadantes diluidos de cada muestra de arroz y se añadieron 100 μL de la solución de anticuerpos para aflatoxinas número 1. Las mezclas se agitaron por 1 min. Los pocillos se incubaron durante 30 min a 25 ºC y luego las soluciones de los pocillos se desecharon. Se lavaron 3 veces con 250 μL de solución de lavado 1X, y posteriormente se agregaron 150 μL de la solución de anticuerpos para aflatoxinas número 2 1X y los materiales se incubaron durante 30 min a 25 °C en oscuridad. Se desecharon las soluciones de los pocillos, a continuación, se lavaron 3 veces con 250 μL de solución de lavado 1X. 100 μL de sustrato TMB se agregaron a cada pocillo y se mezcló suavemente el contenido de los pocillos por un minuto mientras se incubaba a 25 °C. Después de 15 min se adicionaron 100 μL de la solución amortiguadora stop para detener la reacción enzimática. Los pocillos de la placa fueron medidos en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm.

El método ELISA utilizado, corresponde a un protocolo estandarizado o método normalizado (BIOO Scientific, 2015). Adicionalmente, como medida de verificación de desempeño en las condiciones de las mediciones se alternaron muestras de control positivo por duplicado y se determinó con estas el error relativo. En el caso de la zearalenona se utili

zaron como controles los estándares de 1,5 ng/mL y 4,5 ng/mL, y para aflatoxina total los estándares de 0,6 ng/mL y 1,5 ng/mL. El error relativo (ER) se determinó mediante la ecuación (1) a partir de los valores mencionados anteriormente como las concentraciones teóricas (Cteórica) y los resultados obtenidos después del análisis como los valores experimentales (Cexp). Así mismo, la precisión del método se verificó mediante el análisis de réplicas de controles y muestras y se calculó el coeficiente de variación (% CV) promedio del método.

Se obtuvieron las siguientes curvas de calibración para la cuantificación de zearalenona: y=0,2214ln(x) + 0,4954 con un r = 0,977 y y=0,1461ln(x) + 0,2639 con un r=0,997 para aflatoxina total. Los controles de zearalelona de 1,5 y 4,5 ng/mL presentaron resultados experimentales de 1,8 y 5,35 ng/mL, lo que corresponde a ER de 19,9 y 18,9 % respectivamente. Para el caso de aflatoxina total los controles de 0,6 y 1,5 ng/mL presentaron resultados experimentales de 0,69 y 1,74 ng/mL lo que corresponde a ER de 14,3 y 16,3 % respectivamente. El CV promedio de las evaluaciones fue de 1,19 %, valor que no supera el 10 % establecido como límite de control del método. Los resultados positivos a micotoxinas en las muestras de arroz sin cáscara se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados positivos a zearalenona en muestras de arroz sin cáscara

Las curvas de calibración obtenidas para la cuantificación de las micotoxinas evaluadas presentaron una adecuada relación entre la concentración de los estándares y los valores de absorbancia relativa, reflejado por altos coeficientes de correlación (r) de 0,977 y 0,997 para la zearalenona y aflatoxina total, respectivamente. Estos resultados son similares a los reportados por otros autores (Fajardo et al., 2006; Valderrama et al., 2009; Omar et al. 2020), y demuestran el buen desempeño del método aplicado. En la evaluación del error relativo con controles positivos se obtuvieron valores menores al 20 %, lo que indica también un buen desempeño (veracidad) del método, esto con la consideración de que se trata de un método semi cuantitativo.

En la Tabla 1 se puede apreciar que las concentraciones de zearalenona se encuentran entre 1 a 20 μg/kg y 41 a 60 μg/kg para el 34 % y 2 % del total de las muestras, respectivamente. Consecuentemente el 64 % restante de las muestras no evidenciaron la presencia de esta micotoxina.

Debido a que la concentración máxima de zearelonona permitida en arroz no se encuentra establecida en la normativa nacional (INEN, AGROCALIDAD, Ministerio de Salud), se comparó con el umbral de 100 μg/kg establecido por la Comisión de las Comunidades Europeas (2006) en el Reglamento (CE) N°1881 para cereales no elaborados distintos al maíz. De acuerdo con esto, el 100 % de las muestras analizadas cumplen y se encuentran bajo el límite establecido por el mencionado Reglamento. Las muestras con mayor concentración de zearalenona pertenecían a la provincia de Los Ríos, donde un valor de 51,8 μg/kg fue determinado en una muestra proveniente del cantón Vinces. Por otra parte, muestras procedentes de cantones como Nobol, Yaguachi, Santa Lucía y Guayaquil pertenecientes a la provincia del Guayas reflejaron concentraciones entre 2,14 μg/kg y 3,34 μg/kg. En el caso de la provincia de Manabí, muestras procedentes de los cantones Rocafuerte y Sucre exhibieron concentraciones de 2,19 μg/kg y 2,45 μg/kg, respectivamente. Adicionalmente, hay que considerar que es recomendable realizar ensayos confirmatorios de los resultados positivos obtenidos con los métodos de cribado como el ELISA, por ejemplo usando Cromatografía Líquida acoplada a Detector de Espectrometría de Masas, debido a la posibilidad de falsos positivos o variaciones en las concentraciones obtenidas. En este caso, todas las muestras resultaron dentro de los umbrales tomados como referencia, y no fue indispensable su reevaluación por métodos confirmatorios (Okuma et al., 2018). Los resultados obtenidos indican que las muestras de arroz sin cáscara cumplen con la normativa de la UE, sin embargo, es evidente, la presencia de zearalenona en este alimento. Esto podría deberse a las condiciones ambientales favorables para el crecimiento de hongos de las zonas muestreadas, como son la elevada humedad (70 a 80 %) y temperatura (20–30 °C). Además, el Codex Alimentarius indica que los granos pequeños y arrugados pueden presentar más zearalenona que los granos sanos normales (CODEX, 2019).