Purificación de toxina épsilon de Clostridium perfringens Tipo D a partir de sobrenadante de cultivo del microorganismo
Publicado: 18 de marzo de 2009
Por: Esteban Guerra, Doctor en Medicina y tecnología veterinaria. Montevideo, Uruguay
El Clostridium perfringens tipo D es el microorganismo responsable del producir enterotoxemia en lanares. Las principales toxinas producidas por el microorganismo son la alpha y epsilon (E). Siendo la toxina E la responsable de producir la patogenia en ovejas y cabras, ya que incrementa la permeabilidad capilar lo que favorece su absorción a través de la pared intestinal llegando a la sangre y alcanzando niveles críticos con la instalación de un cuadro enterotoxemico.
El objetivo del presente trabajo consiste en la purificación de la toxina E de C. perfringens tipo D para su empleo en test de seroneutralización en pruebas de potencia de vacunas. Para ello una cepa comercial (ATCC) de Cl perfringens tipo D fue cultivada en 1Lt de medio de cultivo Cooked Meat (Oxoid) durante 72 hs.
El sobrenadante del medio fue centrifugado a 10000 rpm durante 30 minutos a 4ºC y posteriormente filtrado en sucesivas etapas por filtros de 1 um ,0.45 um y 0.22 um. La purificación de la protoxina a partir del sobrenadante se realizo en 2 etapas, la primera mediante precipitación salina y la segunda por intercambio aniónico.
La precipitación salina se realizó con solución saturada de sulfato de amonio (35%v/v) agregando pequeños volúmenes y en agitación a temperatura ambiente. Posteriormente el medio de cultivo fue centrifugado a 3500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet conteniendo la protoxina fue resuspendido en 1/10 del volumen original con agua destilada y dializado durante 24horas contra buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2. Posteriormente a la diálisis la protoxina fue purificada mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-Sepharosa).
Al material así obtenido se le ensayaron controles biológicos, mediante desafío de ratones con la fracción purificada activada con tripsina al 0.2% y controles bioquímicos mediante SDS-PAGE. 72 hs posteriores al inoculo intravenoso de los ratones con distintas diluciones de la toxina, fueron evaluadas las muertes siendo positivos hasta una dilución 1/10000. La electroforesis de la toxina purificada fue teñida con coomasie revelando una única fracción de PM 34 Kda. De esta manera hemos purificado toxina E de Cl.
perfringens tipo D con una alta pureza lo que permite su empleo para ensayos inmunológicos, tanto para el test de seroneutralización en pruebas de potencia de vacunas así como de determinación del titulo de anticuerpos en animales vacunados, también a partir de este reactivo se elaborarán anticuerpos policlonales para la elaboración de inmunoensayos que permitan la cuantificación de la protoxina/toxina tanto para la industria (biorreactores) así como para su uso a campo (animales con sospecha de la enfermedad.).
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