resistencia antomicrobiana en cerdos

Resumen: Se realizó un estudio de sensibilidad in vitro frente a diferentes drogas antimicrobianas, en 39 cepas de Escherichia coli aisladas en cerdos lactantes y posdestetados con presencia de diarrea, que resultaron positivas por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) a genes que codifican factores de virulencia. Las cepas estudiadas manifestaron mayor resistencia a antibióticos como la Tetraciclina, Estreptomicina, Nitrofurantoina y Ampicilina. Mientras que mostraron sensibilidad a Florfenicol, Endofloxacina, Ciprofloxacina, Cefalotina, Kanamicina y Gentamicina.

(Palabras clave: Escherichia coli; diarrea; resistencia a antibióticos)

Introducción: Las bacterias han desarrollado varios mecanismos para resistir la acción de los antibióticos. La posesión de un sistema de expulsión activa del antimicrobiano, una especie de bomba expulsora que utilizan para la excreción de productos residuales o tóxicos, con la que pueden eliminar además muchos de estos agentes antibacterianos. La disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana, con la pérdida o modificación de los canales de entrada (porinas) y la producción de enzimas inactivantes de los antibióticos, que permite la inhibición de los amino glucósidos; el cloranfenicol por la acetil transferasa, y el caso más típico, el de las beta lactamasas, para el grupo de los betalactámicos (4, 5). Por último, algunos antibióticos ejercen su acción contra las bacterias uniéndose a una proteína esencial para la supervivencia de estas. La resistencia bacteriana se produce cuando el germen modifica la proteína diana, y cambia su función o produce enzimas distintas.

La resistencia a antibióticos en Escherichia coli está mediada por genes que se incluyen en el genóforo o en los elementos genéticos extracromosomales llamados plasmidios, los cuales no son esenciales para la bacteria en condiciones ordinarias de crecimiento, sino que su presencia se expresa cuando los genes que portan, le confieren nuevas propiedades a la célula, como es la resistencia a los medicamentos. La resistencia mediada por plasmidios está dada por inactivación enzimática del fármaco, mientras que la gobernada o dirigida por cromosomas refleja habitualmente una afinidad disminuida de su molécula blanco para el antibiótico. Esta propiedad de resistencia a los antibióticos se ha incorporado como una de las técnicas para la tipificación biológica de esta bacteria, hallándose valores muy disímiles en cuanto a cepas y especies afectadas.

La antibioterapia constituye una de las alternativas en las medidas de control y lucha contra la colibacilosis del cerdo; sin embargo, en la provincia de Villa Clara, en diferentes granjas porcinas, no se han efectuado estudios de susceptibilidad de E. coli, en antibióticos de otra generación (Florfenicol, Endofloxacina, Ciprofloxacina y Cefalotina) los cuales son de menor utilización para la práctica veterinaria. El objetivo del presente estudio fue evaluar el grado de susceptibilidad o resistencia ante diferentes drogas antimicrobianas en aislados de E. coli a partir de muestras procedentes de cerdos con síndrome diarreico en el territorio.

Materiales y Métodos: Se realizó un estudio de susceptibilidad frente a diferentes drogas antimicrobianas, en cepas de Escherichia coli aisladas en cerdos lactantes y posdestetados con presencia de diarrea, que resultaron positivas por RCP a genes que codifican factores de virulencia enterotoxinas TSa, TSb, TL y verotoxina VT2 (3). Se empleó la técnica de difusión en agar, utilizando los discos de antibióticos (Difco y BioMerieux). Se sembró cada cepa en 5mL de caldo de triptona-soja (TSB) (pH 7.4) (Oxoid) y se incubó (35⁰C / 2-8 h). Se ajustó la concentración bacteriana del cultivo por comparación de su turbidez con un tubo estándar.

Para preparar dicho tubo, se añadió 0.5 mL de Cl2Ba 0.048 M a 9.5 mL de SO4H2 0.36 N y fue distribuido en tubos a razón de 4-6 mL por tubo. Fue humedecida una torunda estéril en el cultivo ajustado y fue inoculado por siembra superficial en placas petri con agar de Mueller Hinton (Difco). El espesor del medio era de 4 mm. Se dejó que el medio absorbiera el inóculo (temperatura ambiente / 3-5 min.). Se colocaron los discos de antibióticos separados entre ambos (2.5 cm.) Se dejó que difundiera el antibiótico (t^a ambiente/15 min.) y se incubó (35⁰C/16-18 h). Se midió el diámetro de los halos de inhibición total del crecimiento y fueron clasificadas las cepas en sensibles, intermedias o resistentes frente a los antibióticos utilizados (Tabla 1).

Para el análisis estadístico de los resultados (resistencia ante los antibióticos) se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS PLUS 4.1 y se realizó una prueba de hipótesis para comparar proporciones de las cepas sensibles o resistentes a las drogas antimicrobianas.

Tabla 1. Antibióticos empleados para estudiar la susceptibilidad de las cepas aisladas.

Grupo	Antibiótico	Disco^a	Diámetro halos en mm
Resistente	Intermedio	Sensible
Penicilinas	Ampicilina	AM10	13	14-16	17
Cefalosporinas	Cefalotina (1ª)	CF30	14	15-17	18
Aminoglucósidos	Estreptomicina	S10	11	12-14	15
Gentamicina	GM10	12	13-14	15
Kanamicina	K30	13	14-17	18
Tetraciclinas	Tetraciclina	TE30	14	15-18	19
Anfenicoles	Cloranfenicol	C30	12	13-17	18
Florfenicol	FFC30	16	17-20	21
Nitrofuranos	Nitrofurantoína	FD300	14	15-16	17
Quinolonas	Ciprofloxacino (fluorada)	CIP5	15	16-20	21
Endofloxacina	END5	16	17-19	20
Diaminopirimidina	Trimetoprima	TMP5	10	11-15	16

Leyenda: a) El número indica la carga del disco en mg, excepto para la Nitrofurantoina en unidades.

Resultados y Discusión

Las cepas toxigénicas aisladas de los cerdos con diarrea en ambas categorías (crías y precebas) mostraron resistencia a 10 antibióticos en E. coli enterotoxigénicos (ECET) y a cinco en E. coli verotoxigénicos (ECVT). En total 35 (89.7%) cepas resultaron resistentes al menos a un antibiótico, 16 (80%) en ECET y 19 (100%) en ECVT.

Fue observado un mayor porcentaje de resistencia ante la Tetraciclína y Estreptomicina en cada categoría de Escherichia coli. ECVT mostraron un mayor porcentaje de aislados resistentes que ECET, sin embargo, tanto la tasa de resistencia, como la tasa de multirresistencia, fue mayor en los aislados de ECET, lo cual se debe a que los aislados enmarcados en esta categoria, mostraron resistencia a una mayor cantidad de antibióticos y a una mayor diversidad de drogas antimicrobianas, o sea, manifestaron mayor polirresistencia (Tabla 2).

Tabla 2. Comportamiento de la resistencia ante los antibióticos empleados.

Antibióticos empleados	Número y porcentaje de cepas resistentes
ECET (n = 20)	ECVT (n = 19)	Total (n = 39)
Tetraciclina	15 (75)	18 (94.73)	33 (84.6)
Estreptomicina	9 (45)	12 (63.15)	21 (53.8)
Cloranfenicol	2 (10)	1 (5.26)	3 (7.6)
Ampicilina	6 (30)	3 (15.7)	9 (23)
Cefalotina	3 (15)	0	3 (7.6)
Kanamicina	2 (10)	0	2 (5.1)
Ciprofloxacina	1 (5)	0	1 (2.5)
Trimetoprima	4 (20)	0	4 (10.2)
Endofloxacina	1 (5)	0	1 (2.5)
Nitrofurantoina	5 (25)	6 (31.57)	11 (28.2)
Florfenicol	0	0	0
Gentamicina	0	0	0
Número total de resistencia	48	40	88
Número de cepas resistentes	16 (80)a	19 (100)b	35 (89.7)
Tasa de multirresistencia	3	2.1	2.5
Tasa de resistencia	2.4	2.1	2.2

Leyenda: Letras desiguales para una misma fila indican diferencias estadísticamente significativas para P ≤ 0.05

La polirresistencia mostrada varió desde dos hasta siete antibióticos. La resistencia dual se manifestó en 20(57.14%), la triple en 6(17.14%), la cuadruple y quintuple en 2(5.71%), respectivamente, siendo máxima la polirresitencia a siete antibióticos en 1 cepa (2.85%). De las 35 cepas resistentes, solo cuatro (11.4%) no mostraron poliresistencia, o sea, solo manifestaron resistencia a un antibiótico, y fue específicamente a la Tetraciclina. Solo cuatro (11.4%) del total de las cepas aisladas, resultaron sensibles a todos los agentes antimicrobianos evaluados. Hubo un mayor porcentaje de aislados resistentes a la Tetraciclina, Estreptomicina, Nitrofurantoína y Ampicilina, con respecto al resto de los antibióticos empleados. La mayor sensibilidad fue observada frente a Florfenicol, Endofloxacina, y Ciprofloxacina (Tabla 3).

Tabla 3. Susceptibilidad antimicrobiana de 39 aislados de Escherichia coli procedentes de muestras de cerdos con diarrea.

Drogas antimicrobianas	Potencia / Disco	No. de cepas (porcentaje)
Susceptible	Intermedio	Resistente
Ampicilina (AM)	10 mg	28(71.7)	2(5.1)	9(23.0)
Cefalotina (CF)	30mg	32(82.05)	4(10.2)	3(7.6)
Estreptomicina (S)	10mg	6(15.3)	12(30.7)	21(53.8)
Gentamicina (GM)	10mg	27(69.2)	12(30.7)	0
Kanamicina (K)	30mg	30(76.9)	7(17.9)	2(5.1)
Tetraciclina (TE)	30mg	6(15.3)	0	33(84.6)
Cloranfenicol (C)	30mg	33(84.6)	3(7.6)	3(7.6)
Florfenicol (FFC)	30mg	39(100)	0	0
Nitrofurantoína (FD)	300U	28(71.7)	0	11(28.2)
Ciprofloxacino (CIP)	5mg	38(97.4)	0	1(2.5)
Trimetoprima (TMP)	5mg	35(89.7)	0	4(10.2)
Endofloxacina (END)	5mg	38(97.4)	0	1(2.5)

Las cepas evaluadas mostraron trece resistotipos o perfiles de resistencia. Los resistotipos que mayor prevalencia mostraron fueron las combinaciones S/TE 42.8%, hallados en 12 ECVT de cerdos con diarrea postdestete (DPD) y en tres ECET de cerdos con diarea neonatal (DN); TE y AM/TE/FD 11.4% respectivamente; el primero, hallado en tres ECET de cerdos con DN y uno ECET en un cerdo con DPD; el segundo, en tres ECVT y uno ECET aisladas en cerdos con DPD. El resistotipo TE/FD fue encontrado en un 8.5%, y fue hallado en tres ECVT, uno de DN y dos de DPD(Tabla 4).

Tabla 4. Patrones de resistencia a multidroga de los 35 aislados de E. coli procedentes de muestras de cerdos con diarrea.

No. de antibiótico	Perfiles de resistencia	No. de aislamiento %
7	TMP-CF-S-K-CIP-TMP-END	1 (2.8)
5	CF-TE-C-FD-TMP	1 (2.8)
5	AM-CF-TE-FD-TMP	1 (2.8)
4	AM-S-TE-TMP	1 (2.8)
4	AM-K-TE-FD	1 (2.8)
3	S-TE-C	1 (2.8)
3	AM-S-TE	1 (2.8)
3	AM-TE-FD	4 (11.4)
2	S-TE	15 (42.8)
2	TE-FD	3 (8.5)
2	AM-TE	1 (2.8)
2	TE-FFC	1 (2.8)
1	TE	4 (11.4)

Leyenda: TMP Trimetoprima, CF Cefalotina, S Estreptomicina, K Kanamicina, CIP Ciprofloxacino, END Endofloxacina, CF Cefalotina, TE Tetraciclina, C Cloranfenicol, FD Nitrofurantoina, AM Ampicilina, FFC Florfenicol.

Los perfiles de resistencia TMP/CF/S/K/CIP/TMP/END, AM/TE, TE/FFC, AM/S/TE, AM/S/TE/TMP, CF/TE/C/FD/TMP fueron encontrados en un 2.8% respectivamente, y todos fueron hallados en cepas de ECET de cerdo con DN. Los resistotipos AM/K/TE/FD, AM/CF/TE/FD/TMP fueron hallados en un 2.8% respectivamente, y encontrados en cepas ECET de cerdo con DPD. El resistotípo S/TE/C fue encontrado en un 2.8% y hallado en un ECVT de cerdo con DPD.

El presente estudio, permitió corroborar el comportamiento de los aislados de un periodo de cinco años, frente a una línea de antibióticos (Amikacina, Gentamicina, Kanamicina, Estreptomicina, Ampicilina, Cloranfenicol) utilizados en el laboratorio provincial de diagnóstico veterinario de la provincia de Villa Clara (Lazo, Leonel material inédito)¹ e incorporar pruebas diagnósticas con mayor número de agentes antimicrobianos , que los empleados en ese estudio, así como evaluar el grado de resistencia y sensibilidad de los aislados en la población de cerdos con diarrea en el territorio, ante antibióticos de otra generación de menor utilización en la práctica veterinaria en la provincia, como es el caso del Florfenicol, Endofloxacina, Ciprofloxacina y la Cefalotina.

En otros estudios realizados (1) se halló un 87.5% de resistencia a la Tetraciclina, 90.6% a la Eritromicina y 100% de sensibilidad a la Kanamicina y Gentamicina respectivamente, en cepas colicinogénicas; 96.8% de resistencia a la Tetraciclina, 88.4% a la Eritromicina y 91.6% y 100% de sensibilidad a la Kanamicina y Gentamicina respectivamente en cepas no colicinogénicas, de un total de 127 cepas de E. coli aisladas en cerdos con diarrea en tres unidades porcinas de la provincia en estudio. Otros autores demostraron la alta sensibilidad de cepas de E. coli aisladas de cerditos recién nacidos con diarrea frente a la Kanamicina y el Cloranfenicol (15).

En un estudio realizado para valorar in vitro, la efectividad de seis antibióticos, frente a la mayoría de las cepas de E. coli patógenas aisladas, a partir de 394 muestras de intestino delgado de cerdos que presentaban diarrea, durante el período 1980-1984, los resultados de la confrontación, mostraron la poca efectividad en la mayoría de los antibióticos, el Cloranfenicol resultó el de superior eficacia (76.6%), mientras la Tetraciclina (27.4%), la Estreptomicina (25.8%) y la Ampicillina (20.2%) fueron de muy baja efectividad. El Cloranfenicol mostró 23.4% de resistencia, la Tetraciclina 72.6%, la Estreptomicina 74.2% y la Ampicilina 79.8% respectivamente (14).

En un estudio efectuado en 117 cepas de E. coli aisladas en cerdos diarreicos menores de 45 días, en unidades de la provincia de Camagüey, fue hallado un 97.1% de resistencia ante la Tetraciclina, 93.2% a Ampicilina, 90% a Eritromicina y 77.7% a Estreptomicina y una máxima sensibilidad a la Gentamicina de un 100% (13).

Estos resultados coinciden en parte, con los de estos autores (13) ya que las cepas estudiadas, manifestaron como factor común la alta resistencia a la Tetraciclina y Estreptomicina.

La resistencia a los antibióticos mostradas por las cepas de E. coli toxigénicas, aisladas en los cerdos con diarrea, no es una característica novedosa, ya que numerosos estudios realizados con cepas aisladas de ganado porcino, en Cuba (1, 15, 13) y en diferentes países (11, 8, 10, 6, 12), han observado el progresivo y alarmante aumento de la resistencia a los antibióticos por cepas de E. coli y al igual que en los trabajos mencionados anteriormente, la mayoría de las cepas fueron resistentes a la Tetraciclina (84.6%) y Estreptomicina (53.8%), mientras que prácticamente la totalidad de las cepas fueron sensibles al Fluorfenicol, Gentamicina, Endofloxacina, Ciprofloxacina y a la Kanamicina, en menor cuantía. Resultados que pudieran atribuirse, a que en la provincia y en Cuba en general, a penas se han utilizado estos agentes antibacterianos (Fluorfenicol, Endofloxacina y Ciprofloxacina); mientras que en otros como la Tetraciclina y Estreptomicina se puede haber abusado.

En estudios realizados en cepas de E. coli aisladas de lechones neonatos que padecían diarrea (7) se encontró, que el mayor grado de resistencia fue para la Tetraciclina (96%), Sulfamethoxazole (89%), Kanamicina (84%), Estreptomicina (82%), Florfenicol (64%) y Cloranfenicol (53%). Este mismo autor considera que las Tetraciclinas, Aminoglucósidos y Sulfonamidas son utilizados ampliamente en la producción porcina en el tratamiento y prevención de enfermedades y como promotores del crecimiento, lo cual ha generado alto grado de resistencia a estas drogas.

Coincidimos con otros investigadores (2), con respecto a que la capacidad de E. coli para adquirir genes de resistencia, hace impredecible su sensibilidad, por lo que esta debe determinarse siempre mediante un antibiograma. Una proporción elevada (40-90%) de las cepas son resistentes a la Ampicilina, la Estreptomicina, las Tetraciclinas, y las Sulfamidas. También son muchas (15-30%) las cepas resistentes a las Cefalosporinas de primera generación, la Neomicina, la Kanamicina, el Cloranfenicol, la Nitrofurantoina, y las Quinolonas.

En estudios realizados por investigadores (2, 10), encontraron que los antibióticos, los cuales presentan un menor índice de resistencia ante E. coli son: la Amoxicilina asociada al ácido clavulánico, las Cefalosporinas de segunda y tercera generación, la Gentamicina, la Tobramicina, la Amikacina, la Colistina, y la Polimixina B. Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores (9) en un estudio que mostró resistencia mayoritaria a la Tetraciclina en cepas de E. coli aisladas en cerdos con diarrea en Québec, Canadá.

En estudios realizados en China (16) se encontró un 98% de resistencia a la Tetraciclina, 77% a la Estreptomicina, 79% a la Ampicilina y 79% a la Ciprofloxacina en aislados de E. coli procedentes de cerdos con diarrea. Estos resultados demuestran un mayor grado de resistencia a la Tetraciclina, Estreptomicina y Ampicillina, que el hallado en este estudio (Tetraciclina, Estreptomicina y Ampicilina mostraron un 84.6%, 53.8% y 23% de resistencia respectivamente) y una gran diferencia con respecto a la Ciprofloxacina, que en este caso solo se halló un 2.5% de resistencia.

Estos resultados coinciden con los de otros investigadores (7) que en un estudio realizado en Corea, quedó demostrado, que las cepas de E. coli aisladas de animales, eran altamente resistentes a los agentes antimicrobianos comúnmente usados, tales como, la Tetraciclina, Sulfametoxazol, Estreptomicina, Ampicilina y Carbenicilina.

Otro aspecto a considerar desde el punto de vista de la terapéutica, es que se corrobora la efectividad in vitro de antibióticos de amplio espectro como la Kanamicina, Gentamicina, Cloranfenicol ante las cepas de E. coli productoras de diarrea en cerdos, y que los fármacos de menor uso en las condiciones de producción en nuestra provincia, tales como, el Florfenicol, Endofloxacina, Ciprofloxacina y la Cefalotina mostraron mayor efectividad in vitro ante las cepas enteropatogénicas estudiadas; aspecto que debe considerarse en la política de uso racional de las drogas antimicrobianas para combatir las diarreas producidas por E. coli en cerdos en la provincia y en la estrategia terapéutica a tomar dentro del grupo de medidas contra epizoóticas que se deben cumplimentar ante un proceso epidémico, de acuerdo con el programa de lucha y control de la enfermedad, establecido por el Instituto de Medicina Veterinaria, el cual debe aplicarse ante la presencia de un episodio de colibacilosis porcina en el territorio.

Conclusiones:

Las cepas estudiadas manifestaron mayor resistencia a antibióticos como la Tetraciclina, Estreptomicina, Nitrofurantoina y Ampicilina, mientras que otras mostraron sensibilidad a Florfenicol, Endofloxacina, Ciprofloxacina, Cefalotina, Kanamicina y Gentamicina.

Agradecimientos:

Al Dr. C Jorge Blanco Álvarez, por su colaboración con los medios y equipamiento necesarios para la investigación en el laboratorio de Referencia de E. coli (LREC) del Departamento de Microbiología de la Facultad de Veterinaria en la Universidad de Santiago de Compostela (USC).

Al Dr. C Edilbert Van Drissche del Laboratorio de Proteínas del Instituto de Biología Molecular de la Universidad libre de Bruselas, por facilitarme la participación en un proyecto de investigación internacional y el financiamiento de estancias en el extranjero para realizar estos experimentos.

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