¿Cómo afecta el virus de PRRSV al sistema inmunológico del cerdo y cuáles son las consecuencias de la infección?

Una de las características más importantes del virus de PRRSV es el daño al sistema inmunológico del huésped lo que causa un estado de inmunosupresión. El virus también puede replicarse en las células de la médula osea provocando una hipoplasia que se manifiesta por una disminución de los glóbulos blancos en formación.

¿Cuál es la capacidad de absorción y acumulación de la Tylvalosina en diferentes tipos de células en cerdos?

Stuart. A et al.,(2007) Investigaron la capacidad de absorción y acumulación de la Tylvalosina en tres tipos de células en los cerdos, (HTR-18), Caco-2, y neutrófilos (células blancas), donde se presenta un transpaso de el espacio apical de dichas células a una acumulación intracelular de 428 µg/g en 30 minutos (ver Figura N.3a) con un máximo de 593 µg/g a los 120 minutos y de 375 µg/g a los 240 minutos, de igual manera la TV presento una acumulación intracelular en células blancas de 57.4 µg/g a los 20 minutos comparado con la absorción de tilmicosina que fue de 37.5 µg/g (ver Figura N. 3b).

¿Qué papel juega el pH neutro en la absorción efectiva de la Tylvalosina en cerdos?

Por lo anterior es necesario que los preparados de TV, para que logren un buen efecto lipofílico en animales in vivo, se deben diluir en aguas que posean un pH neutro (6.5 a 7.5).

Tylvalosina para inhibir la proliferación del virus de PRRS

1.0 Introducción

El agente causal del PRRS, (síndrome respiratorio y reproductivo porcino) fue identificado en Estados Unidos y Holanda en la década de 1.990s [1,2]. El virus de PRRSV (por sus siglas en ingles) es un virus RNA mono catenario positivo y envuelto de cadena sencilla como material genético que no se replica usando ADN intermediario, la replicación tiene lugar principalmente en el citoplasma y no es tan dependiente del ciclo celular [3].

El virus de PRRS pertenece al genero Arterivirus, familia Arteriviridae, Orden Nidovirales [3], de acuerdo con la secuenciación viral PRRSV esta dividido en dos genotipos superiores (PRRSV-1 , Betarterovirus suid-1 y PRRSV-2 Betarterovirus suid-2) ambos comparten una secuencia de identidad de sus nucleótidos entre el 50-70% [4], a diferencia de los virus del genero Arterovirus que exhiben un tropismo celular relativamente muy amplio, la infección por el virus de PRRSV esta restringido al linaje de los Macrófagos y Monocitos Alveolares (PAMPs: Porcine Alveolar Macrophages (Por sus siglas en ingles)) [5]. Los Micro ARN (miARN) son una clase conservada de pequeños ARN no codificantes que desempeñan funciones claves en la regulacion de los procesos biologicos de las celulas eucariotas incluido el crecimiento, proliferacion y diferenciacion asi como el desarrollo celular. Los miARN funcionan como reguladores de la expresion genica en los niveles posteriores a la transcripcion genica atraves de una complementariedad perfecta o imperfecta de las semillas de ARN mensajero (ARNm), lo que resulta en una degradacion de la traduccion del ARNm [6]. Nueva evidencia indica que el virus de PRRSV puede escapar a la respuesta inmune del huesped modulando los miARN [7,8].

Una de las caracteristicas mas importantes del virus de PRRSV es el daño a el sistema inmunologico del huesped lo que causa un estado de inmunosupresion el virus tambien puede replicarse en las celulas de la medula osea provcando una hipoplasia que se manifiesta por una disminucion de los globulos blancos en formacion [9,10] el virus afecta la funciones del timo como resultado se observa frecuentemente una induccion retrasada o inhibida de los Interferones (INFs) tipo I (INFα y INFβ ) y tipo II (INFγ) [11,12]. Los interferones (INFs) son esenciales en la inmunidad antiviral innata contra virus ivasores, porque inhiben la propagacion intracelular y la transmision intercelular del virus [13] Los INFs tipo I y Los INFs II a menudo trabajan juntos para estimular la respuesta inmune innata y adaptativa para eliminar virus [13,14].

Existen muchas estrategias por la que los virus bloquean la acción de los INFs, que incluyen la inhibicion de la produccion de INFs, la inhibicion de la señalizacion para la accion de INFs y el bloqueo de la accion de las proteinas inducidas por interferones con actividad antiviral, el virus de PRRS inhibe la fosforilacion de la proteina IRF3 (ver figura 1) y la traslocacion nuclear interfiere con la ubiquitinacion del RIG-I, mediada por el TRIM25 de esta forma el viris de PRRS molula la actividad antiviral de la respuesta inmune atraves de la desregularizacion de la produccion de interferones (INFs) logrando establecer una infeccion constante en los cerdos [15,16,17,18].

La utilizacion de farmacos (antibioticos) ya existentes son una herramienta prometedora para detectar la capacidad antiviral de estos, dado que se conocen los datos de seguridad y eficacia de estos medicamentos [19]. Los Macrolidos son un grupo de antibioticos que poseen un anillo de lactona macrociclico; y estan aprobados para su uso en Medicina Veterinaria, a este grupo pertenecen la tylosina, tylvalosina, tilmicosina, tulatromicina, y tildiprosina,quienes en general tienen actividad frente a Mycoplasmas spp y bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas. La Tylvalosina (TV) es un derivado semisintetico de la tylosina de tercera generacion; al cual se le agrego un anillo de lactona el 3-A-O Acetil isovaleril tartrato de tylosina posee una muy baja toxicidad y se concentra de manera muy eficaz en los macrofagos alveolares que son el objetivo del virus de PRRSV para generar la inmunosupresion [20]. Se ha demostrado que los macrolidos poseen efectos inmunomoduladores varios estudios de investigacion demuestran que tienen eficacia contra el virus de PRRSV, El herpes simple y el dengue [21]. Se ha demostrado que la tylvalosina tiene efectos antinflamatorios y dismiunuye la lesion causada por el virus de PRRSV en ratones [22].

Figura N.1 Desarrollo de Viremia, Evasion de la Respuesta inmune y Persistencia Viral del Virus de PRRSV - Aapatdo de Fredmoore L. Orosco (2024)[18]

Actividad Antiviral de la Tylvalosina Tartrato Sobre el Virus de PRRSV Por la Vía de la Activación Nrf2-HMOX1 - Image 1

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^{El ciclo de vida del Virus de PRRS comienza con la unión a la siloadehesina(1) que desencadena la endocitosis estimulada por la claritrina (2) para fusionarse con un endosoma (3) luego se desensambla el virus y se libera ARN viral (4) para su teaduccion en el retículo endoplasmatico (5) las proteínas traducidas se ensamblan en nuevos viriones (5,6,7) esta nueva serie de viriones se libera fuera de la célula (8), y por lo tanto el virus de PRSS nunca interactuó con el IRF3/ que bloquea la fosforilacion no activando los mensajeros de los Interferones INFs}

1.1 Cuantificación y determinación de la Tylvalosina es el plasma sanguíneo del cerdo

La Tylvalosina es un antibiótico moderno perteneciente al grupo de los macrolidos conformado por un grupo de 16 anillos de lactona derivado de la tylosina al cual se le agrego el grupo 3-Acetil 4-O isovaleril tartrato; formando una nueva molécula denominada Tylvalosina (TV) (Acetilisovaleril tartrato de tylosina) [22] Los macrolidos son usados en las aves y en los cerdos para el tratamiento de infecciones respiratorias y entéricas causadas por bacterias, incluidas las causadas por las especies de Mycoplasmas Spp [23]. Hernandis et al., 2022 [24]., reporto información concluyente sobre la forma de detección de TV en el plasma sanguíneo de los cerdos, El método usado fue de cromatografía de alta resolución con detección ultravioleta (HPLC/UV) [25] quienes reportaron que al usar 5mg/k de TV in vivo la concentración del antibiótico que se recupero fue del 93.87% en la primera muestra de suero sanguíneo del cerdo a los 6,027 y 14,337 minutos; usando para su medición una longitud de onda mínimo de 236 nm mAU (mAU: Medida de ondas de luz ultravioleta), la cual se mantuvo estable entre 520 y 633 mAU (ver Figura N.2).

Figura N.2 Espectro de Absorción de la Tylvalosina por HPLC/UV (mAU: nm nanómetros)[25].

Actividad Antiviral de la Tylvalosina Tartrato Sobre el Virus de PRRSV Por la Vía de la Activación Nrf2-HMOX1 - Image 3

1.2 Acumulación Intracelular y Transporte Transepitelial de la Tylvalosina

Stuart. A et al.,(2007) [20], Investigaron la capacidad de absorción y acumulación de la Tylvalosina en tres tipos de células en los cerdos, (HTR-18), Caco-2, y neutrófilos (células blancas), donde se presenta un transpaso de el espacio apical de dichas células a una acumulación intracelular de 428 μg/g en 30 minutos (ver Figura N.3a) con un máximo de 593 μg/g a los 120 minutos y de 375 μg/g a los 240 minutos, de igual manera la TV presento una acumulación intracelular en células blancas de 57.4 μg/g a los 20 minutos comparado con la absorción de tilmicosina que fue de 37.5 μg/g (ver Figura N. 3b).

Figura N 3. Acumulacion Intracelular de Tylvalosina (Adaptado de Stuart.A.et al.; 2007 [20])

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^{F(a) Transpaso transepitelial a celulas apicales y acumulacion intracelular en celulas Caco-2 de Tylvalosina (apical med: celulas apicales mediales, cell: Celulas entericas).Figura N.3 (b) Concentracion de Tylvalosina en celulas blancas en μg/ml en un periodo de tiempo de 10, 20, y 30 minutos a una concentración de 10μg/ml, Adaptado de Stuart.A.et al; 2007[20]).}

El gradiente de la alta concentracion de la Tylvalosina en los enterocitos y en los macrofagos; puede ser explicado por su alta capacidad de acumulacion en los tejidos acidos como los lisosomas celulares [26], Por lo anterior demostrado es importante destacar que la conformacion molecular del 3-Acetil, 4-Isovaleril tartrato; tiene un carácter hidrofobico que es altamente eficiente absorbido por las celulas entericas y la subsequente acumulacion en los compartimentos acidos [26]. Es posible que el proceso de traspaso hacia la membrana citoplasmatica y de acumulacion en el citosol para la concentracion de vesiculas acidificantes; se deba al proceso de difusion pasiva dependiente del gradiente de concentacion [27]. La capacidad de la TV para lograr pasar la membrana celular y acumularse depende de su carácter de hidrofobicidad donde el pKa tienen un papel muy determinante, La literatura reporta que el pKa (Constante de disociacion: Fuerza de una base o un acido para disociarse en un medio acuoso) del grupo 3-Acetil 4-O isovaleril tartrato de tylosina es de 7.6 [27], Por lo anterior es necesario que los preparados de TV, para que logren un buen efecto lipofilico en animales in vivo, se deben diluir en aguas que posean un pH neutro (6.5 a 7.5) [28].

Considerando las caracteristicas claves de la infeccion por el virus de PRRS incluidas la inmunosupresion y la fuerte lesion pulmonar inducida por la inflamacion esta revision sitematica demuestra que la Tylvalosina puede inhibir la replicacion del virus de PRSSV y disminuir la fuerte inflamacion pulmonar, al modular la respuesta inmune en cerdos infectados con PRRS.

2.0 Materiales y Metodos

2.1 Revision de literatura

Se realizo la busqueda de los estudios de investigacion sobre el efecto antiviral de la Tylvalosina(TV) sobre el virus respiratorio y reproducutivo porcino (PRSS) en los cerdos, revisando los estudios publicados entre los años 2005 hasta 2024, se incluyeron los estudios publicados en ingles y español usando las bases de datos computarizadas PUB MED, MED LINE, SCIENCE DIRECT,BMC VETERINARY RESEARCH, Y MDPI, Todos los estudios fueron revisados para obtener la informacion requerida por el QUALITY CONSORT, que incluyo tamaño de la muestra, numero de animales desafiados y tratados, numero de animales desafiados y no tratados, dosis de Tylvalosina usada en μg/ml (ppm), esquema de dosificación, porcentaje de disminución del virus de PRRS.

2.2 Búsqueda de literatura

Se uso la combinación de las palabras claves de la pregunta primaria que fueron las siguientes:
[(Pig OR Swine OR Herd)AND(Antiviral Effect Against to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome OR Prrs )AND(Tylvalosin OR 3-A, 4-O Acetyl Tylosin Tartrate)],Se identificaron 6 estudios en ingles, que contienen la información del efecto antiviral de la TV frente a desafíos del virus de PRRS, comparados con el grupo control negativo, se seleccionaron 5 estudios y se elimino 1 por no contener información sobre el porcentaje (%) de disminucion del virus de PRRS

2.3 Análisis estadístico

Se realizo un análisis de varianza (ANOVA) para 5 estudios seleccionados, frente a la hipótesis nula HO: Disminución (%) del virus de PRRS con el uso de diferentes dosis de Tylvalosina; con una prueba de Tukey al valor de P< 0.05 (95% de confianza), luego construyendo una regresión simple como valor predictivo que dirijio la evaluación al análisis del estadístico de determinación de residuos Durbin-Watson que estimo significancia de correlación de los datos por el programa estadístico Stat Advaisor.

3.0 Resultados

Cuadro N1. Estudios seleccionados (n=5) que cumplen con los requisitos para la evaluación del efecto antiviral de la Tylvalosina sobre el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino.

^{Patente DK/EP 204366 T3: Patente autorizada del gobierno de Dinamarca en 2014, sobre ensayos de actividad antiviral de la Tylvalosina.}

Cuadro N2. Variacion en la concentracion del virus de Prrs luego del tratamiento con Tylvalosina(TVN)

^{(µg/ml): Dosis de Tylvalosina en microgramos/mililitros, Cepa: Cepas de el Virus de PRRS evaluadas no homogeneas, Dosis 0: Dosis 0 del grupo control negativo, Media: Media geometrica según la dosis usada}

3.1 Análisis de Varianza para Concentración Virus PRSS - Suma de Cuadrados Tipo III

Figura N4. Se aprecia que no existe efecto significativo de la concentración de Tylvalosina(TV) sobre la cantidad del virus de PRRS (valor P=0,3474)

3.2 Regresión Simple - Virus PRSS vs. Concentración Tylvalosina (μg/ml)

Figura N5. La salida muestra los resultados de ajustar un modelo reciprocal-Y para describir la relación entre Cantidad de Virus PRSS y Concentracion de Tylvalosina ug/ml. (P=0.2737)

En la figura N4. Se observa que no hay efecto significativo entre la concentracion del virus de PRRS (expresado en %) frente a diferentes dosis de TV (P=0.03474), aunque el el cuadro de calculo de las medias geometricas la dosis de (0 μg/ml) presenta una media de 58.6% y disminuya a 9% cuando se usa una dosis de 40 μg/ml, lo anterior representa el 49.6% de disminución de la carga viral.

Análisis de Varianza de la regresion lineal (ver Figura N5)

^{Coeficiente de Correlación = 0,441304}
^{R-cuadrada = 19,4749 %}
^{R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 6,05407 %}
^{Error estándar del est. = 0,0314542}
^{Error absoluto medio = 0,0188995}
^{Estadístico Durbin-Watson = 1,96386 (P=0,3055)}
^{Autocorrelación de residuos en retraso 1 = -0,294889}

Figura N5 Se puede observar que el modelo arroja la ecuación del modelo ajustado es :

Puesto que el valor P en la tabla ANOVA es mayor o igual a 0,05 (valor P=0,2737), no hay una relación estadísticamente significativa entre Cantidad de Virus PRSS y la Concentracion de Tylvalosina μg/ml con un nivel de confianza del 95,0% ó más.

El estadístico R-Cuadrada expresa que el modelo ajustado de la variabilidad en Concentración Virus PRSS, indica que la Tylavosina (TV) afecta a la concentración del virus en un 19,47%. Por otro lado, El Coeficiente de correlación es igual a 0,441304, indica una relación relativamente débil entre las variables.

El estadístico de Durbin-Watson (DW) examina los residuos para determinar si hay alguna correlación significativa basada en el orden en el que se presentan en el archivo de datos. Puesto que el valor-P (P=0.3055)es mayor que 0,05, no hay indicación de una autocorrelación serial en los residuos con un nivel de confianza del 95,0% y a su vez una validez en las serie de datos, respectivamente.

4.0 Discusion

El Sindrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), es considerada una de las patolgias de mayor impacto economico en la industria porcina, El virus causante de PRRS se caracteriza por presentar una alta variacion genetica y consecuentemente una alta variacion antigenica que conduce a los porcinos a presentar una inmunosupresion constante que desencadena una fuerte respuesta inflamatoria e induce a una coinfeccion con patogenos secundarios, El uso de la vacuna para prevenir la presentacion de la enfermedad en el campo es una herramienta valiosa; sin embargo se presenta una baja proteccion cruzada porque el virus presenta una alta mutacion genetica, que causa aparicion de nuevos brotes de PRRS, provocando una viremia, aumentando el riesgo de reversion de la virulencia y causando una recombinacion con los virus de campo [30]. La Tylvalosina (TV) (3-A 4-O Isovaleril Tartrato de Tylosina) es un derivado sintetico de tercera generacion de la Tylosina tartraro con un amplio espectro que puede ejercer varias actividades farmacologicas, Zhao et al., 2014 demostro la fuerte actividad antioxidante y antinflamatoria estudiada en macrogfagos RW267 asi como en lechones desafiados con el virus del PRRS y se concluyo que al usar TV se disminuyo significativamente la secrecion de citoquinas proinflamatorias IL-8, IL-6, IL-1b, TNF-α; e igualmente con la produccion de radicales libres (ROS) inducida por lipopolisacaridos se concluyo que al usar 10 μg/ml la concentración de ROS disminuyo a las 36 horas en cerdos desafiados con el virus de PRSS tratados con TV A 8 μg/ml e igualmente en los desafiados con PRRSy tratados con TV a se disminuyo la cantidad de ROS a 2μg/ml, en otro modelo de investigación de un desafío inicial a las 12 horas con virus de PRRS se uso 24μg/ml de TV y de 7 μg/ml de TV para cerdos desafiados con el virus de PRRS se disminuyo significativamente la concentración de ROS y la lesión tisular y se redujo al disminuir el reclutamiento la activación de las células inflamatorias por la fosfolipasa A; también se considero que la Tylvalosina tiene propiedades antivirales al inhibir de forma no especifica la proliferación del virus de PRRS tanto in-vitro como in-vivo. En esta revisión sistemática se observo que en general la TV disminuye la concentración viral dependiendo de la dosis usada y la cepa de desafío (ver cuadro N2); donde la carga viral paso en promedio del 58.7%(inicial para todas cepas evaluadas) hasta 9%(concentración final de todas cepas evaluadas), (disminución porcentual del 84.6%) con dosis de 0μg/ml hasta 40μg/ml (P=0.3474) diferencia estadísticamente no significativa

En el análisis individual según la cepa, la dosis que mas impacto tiene es 10μg/ml donde frente a las cepas europeas la disminución de la carga viral fue del 85.7% y frente a las cepas chinas fue del 97.3%. Sin embargo el mecanismo por el cual la TV inhibe la replicación del virus aun no esta bien definido; Xingzhen Tanget al., (2023) establecio un modelo de investigacion in vitro para evaluar tres tipos de Tylvalosinas solubles para evaluar el posible mecanismo de accion antiviral mediante analisis de transcriptomica en diferentes fases de desafio, los resultados obtenidos en concentraciones de seguridad de 40μg/ml de tres Tylvalosinas en macrófagos alveolares y células MARC145 arrojaron una disminución del virus de PRRSV en un 90%. (ver figura N6).

Para identificar el proceso intracelular por el cual la Tylvalosina presenta espectro antiviral se llevo a cabo un modelo de investigación se secuenciación del DNA por transcriptomica; basados en el análisis de la transducción celular de KEGG (Moléculas de transformación celular) se logro identificar que la Tylvalosina puede regular la transducción de esas señales, la proteólisis y la actividad de la oxido-reducción así como algunas vías de digestión y absorción de proteínas intracelulares, la vía de señalización PI3K-AKt vía de señalización FoxO, estas vías se relacionan con la respuesta inmune contra PRRS. De igual manera; Xingzhen Tang et al., (2023) establece claramente que la transcripción de la enzima Hemo Oxigenasa 1 (HMOX1) está disminuida aproximadamente 10 veces en los grupos tratados con Tylvalosina o desafiados y tratados con Tylvalosina (Tylvalosina y Tylvalosina + PRRSV, y su proteína codificante ha sido conocida como un inhibidor en la etapa temprana de la infección por PRRSV esta inhibe la oxidación inducida por el virus mediante la activación por de la vía Nrf2-HMOX1, por lo anterior se sugiere que al inhibir la expresión de la Hemo Oxigenasa 1 (HMOX1) se inhibe la replicación del virus de PRRS siendo este uno de los mecanismos por los cuales se presenta capacidad antiviral de la Tylvalosina.

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Figura N6. (A) Disminucion de la concentracion del Virus de PRRS medido con Luciferasa. Tomado de Xingzhen Tang ., et al (2023).(B) Concentracion Final del virus de PRRSVen %. Revision sitematica. Salazar et al., (2024).

Shi. H ,.et al (2023) demostro que la Tylvalosina inhibe la replicacion del virus de PRRSV al inhibir la activacion del factor NF-κB, estos utilizaron un modelo infectando celulas MARC145 con el virus de PRRS cepa CC-YY (cepa china) y las enfrentaron a diferentes diluciones de Tylvalosina de 0,2, 10, 25, 50 μg/ml y se midió la actividad del factor NF-κB utilizando un sistema de medicion de Luciferasa dua, el cual informo una carga inicial de 6 NF-κB a 0μg/ml a 1,5 NF-κB a 50μg/ml que representa el 75% menos de carga viral de igual manera se demuestra una disminución muy marcada en las citoquinas pro- inflamatorias IL-6, IL8, TNF-α, Sugiriendo la capacidad anti- inflamtoria de la Tylvalosina, esta caracteristica fue demostrada por Moges, R. (2017), Los hallazgos indican que TV aumenta la apoptosis de neutrófilos y macrófagos porcinos de manera dependiente de la dosis y del tiempo, sin afectar los niveles de necrosis.LA TV también modula los mediadores de la inflamación, aumentando los mediadores lipídicos pro-resolutivos (LXA4 y RvD1) en los neutrófilos y regulando a la baja los mediadores proinflamatorios en los neutrófilos (LTB4) y en los macrófagos estimulados (CXCL8 e IL-1α). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la Tylvalosina tiene propiedades inmunomoduladoras in vitro, incluida la inducción de la apoptosis de leucocitos, la inhibición de citoquinas proinflamatorias y mediadores lipídicos proresolutivos. Los estudios futuros con lechones vivos ayudarán a determinar si estos efectos pueden traducirse en beneficios antiinflamatorios en el desafio de la enfermedad inflamatoria que afecta el sistema pulmonar del cerdo.

5.0 Conclusiones

Usando concentraciones máximas segura (≤40 μg/mL) de Tylvalosina tartrato, es posible que se pueda inhibir la proliferación del virus de PRRS en las células de una manera dependiente de la dosis, y permanecer en la concentración efectiva durante un período dependiente del uso del antibiótico. Los datos de transcriptómica revelan los perfiles dinámicos del transcriptoma del DNA y las funciones de los DEG en células tratadas con Tylvalosina en células infectadas con PRRSV; la enzima Hemo Oxigenasa 1 (HMOX1) está disminuida aproximadamente 10 veces en los grupos tratados con Tylvalosina, esta inhibe la oxidación inducida por el virus, por lo tanto se disminuye el estrés activo mediante la activación por la vía Nrf2-HMOX1, lo que proporciona pistas importantes para comprender el mecanismo del efecto anti-PRRSV de la Tylvalosina Tartrato.

^{6.0 Conflicto de intereses: Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses para lograr los objetivos de la misma.}

Tylvalosina para inhibir la proliferación del virus de PRRS

Actividad Antiviral de la Tylvalosina Tartrato Sobre el Virus de PRRSV Por la Vía de la Activación Nrf2-HMOX1

ACITT AQUA

ACITT 100